Gymnosporia chevalieri叶正己烷提取物及两种三萜化合物的细胞毒性、转移相关效应与α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

《RSC Advances》：Insights into cytotoxic, metastasis-related effects and α-glucosidase inhibitory activities of the n-hexane extract and two isolated triterpenoids from Gymnosporia chevalieri leavesOpen Access

　　

本研究首次系统探讨了来自Gymnosporia chevalieri叶的正己烷提取物（GCL）及两种分离化合物β-香树脂酮醇（β-amyrenonol，GC3）和3,4-断-29-羟基木栓烷-3-酸（3,4-seco-29-hydroxyfriedelan-3-oic acid，GC14）的细胞毒性、转移相关效应及α-葡萄糖苷酶抑制活性。研究人员采用MTT法在A549和H292肺癌细胞中评估了细胞毒性和抗增殖活性，通过Transwell实验评估了抗迁移和抗侵袭活性，并利用基于酶的实验体外评估了α-葡萄糖苷酶抑制活性。GC14对两种细胞系均表现出比GC3更强的细胞毒性。此外，GC14降低了H292细胞的增殖，并显著抑制了细胞迁移和侵袭。GCL也表现出显著的抗迁移和抗侵袭活性。另外，GC14对作为筛选替代模型的酿酒酵母（S. cerevisiae）α-葡萄糖苷酶表现出中等程度的抑制作用。计算机模拟（In silico）研究提示两种化合物可能与微管蛋白（tubulin）、BCL-2和α-葡萄糖苷酶存在潜在相互作用，对接分数范围为?7.5至?9.0 kcal mol?1。100 ns分子动力学（MD）模拟表明，所有六个蛋白质-配体（GC3、GC14）复合物均保持了整体结构稳定性。GC14表现出比GC3更大的内部构象灵活性，但仍处于相对狭窄的构象范围内。MM/GBSA分析揭示了靶点依赖的相对能量趋势。总体而言，这些发现为GCL、GC3和GC14的生物活性提供了初步证据，值得进一步研究其效应，尤其是GC14对癌细胞的选择性。

一、研究背景与科学问题

肺癌（lung cancer，LC）仍是全球癌症相关死亡的首要原因，2022年估计死亡人数达180万。除吸烟和老龄化等既定风险因素外，糖尿病（diabetes mellitus，DM）已成为肺癌的重要合并症和潜在风险因素。由于葡萄糖代谢重编程是肺癌的标志性特征，而糖尿病中葡萄糖稳态被根本性破坏，糖代谢失调被认为是这两种疾病之间的重要生物学联系。天然产物长期以来被认为是药物发现中结构多样的生物活性分子的重要来源，许多化合物表现出有前景的抗癌和抗糖尿病活性。

Gymnosporia chevalieri是卫矛科（Celastraceae）越南特有物种，近期已成为有前景的生物活性三萜类化合物来源。在研究人员此前的研究中，甲醇提取物表现出显著的生物活性，而其正己烷馏分对A549非小细胞肺癌细胞表现出最强的抗增殖活性，且在所有馏分中三萜含量最高。随后对该生物活性馏分的植物化学研究分离出β-香树脂酮醇（GC3）和一种新三萜化合物3,4-断-29-羟基木栓烷-3-酸（GC14），二者被选为进一步生物学研究的最有前景的候选化合物。

二、研究内容与主要结论

本研究全面评估了正己烷提取物（GCL）、GC3和GC14对非小细胞肺癌细胞的细胞毒性活性及其α-葡萄糖苷酶抑制活性。此外，进行了分子对接以评估GC3和GC14与微管蛋白和BCL-2的结合亲和力，并通过分子动力学（MD）模拟评估了所得配体-蛋白质复合物的稳定性。

在A549细胞中，GC3和GC14处理导致细胞活力随浓度增加而显著下降。GC14表现出比GC3略强的细胞毒性活性，IC₅₀值分别为216.0 ± 16.59和251.1 ± 14.65 μM。GCL提取物也降低了细胞活力，IC₅₀值为148.7 ± 33.45 μg mL^?1。顺铂表现出最高效力，IC₅₀值为84.5 ± 4.07 μM。在H292细胞中，GC14表现出比GC3更强的细胞毒性活性，IC₅₀为144.6 ± 11.72 μM，而GC3为167.0 ± 9.78 μM。GCL提取物表现出中等细胞毒性，IC₅₀值为176.1 ± 12.03 μg mL^?1。从构效关系角度看，GC14增强的细胞毒性可能归因于羧酸和羟基等官能团，这些基团可能增加其极性、氢键能力和对细胞内分子靶标的结合亲和力。

在细胞增殖实验中，GC3和GC14在较高浓度下显著抑制H292细胞增殖。GC3在50 μM时显著将相对细胞增殖降低至对照水平的约80%。GC14在相同浓度下将细胞增殖降低至对照的约65%，表现出更明显的抑制作用。GCL在所测试浓度范围内未显著改变细胞增殖。在A549细胞中，三种样品均未显著影响细胞增殖。

在迁移实验中，GC3在10和20 μM时显著抑制A549细胞迁移，分别将迁移降低至对照水平的约65%和60%。GC14在相同浓度下将迁移分别降低至约50%和25%，表现出更明显的抑制作用。GCL以浓度依赖性方式显著抑制细胞迁移。在H292细胞中，GC3在所有测试浓度下均显著抑制细胞迁移，GC14也表现出有效的抗迁移活性，GCL同样以浓度依赖性方式显著抑制细胞迁移。在侵袭实验中，GC3、GC14和GCL均显著降低了A549和H292细胞的侵袭能力。GC14通常表现出最强的抗侵袭活性，GCL也显示出明显的侵袭抑制作用，尤其是在H292细胞中。GC14对迁移和侵袭的抑制作用比其直接细胞毒性作用更显著，表明其生物活性不仅仅是细胞活力降低的结果。

在α-葡萄糖苷酶抑制实验中，GC14表现出抑制活性，IC₅₀值为140.0 ± 2.32 μM，GCL的IC₅₀值为259.5 ± 2.26 μg mL^?1。GC3活性相对较弱，在500 μM时仅产生26.4%的抑制。这些发现表明对酵母α-葡萄糖苷酶筛选模型具有弱至中等的抑制活性。酵母α-葡萄糖苷酶广泛用于初步抑制筛选实验，但应视为初步结果，不应直接解释为抗糖尿病功效的证据。

三、关键技术方法

研究人员采用了以下主要关键技术方法：从越南广治省达克容县采集G. chevalieri叶片，经甲醇提取、正己烷和乙酸乙酯分配萃取获得GCL，并分离纯化出GC3和GC14两种三萜化合物；采用MTT法评估A549和H292肺癌细胞的细胞毒性和抗增殖活性；采用Transwell迁移和侵袭实验评估抗迁移和抗侵袭活性；采用基于酶的实验评估α-葡萄糖苷酶抑制活性；采用AutoDock Vina进行分子对接，评估GC3和GC14与微管蛋白（1JFF）、BCL-2（6O0K）和α-葡萄糖苷酶（5ZCC）的结合亲和力；采用100 ns分子动力学（MD）模拟评估六个蛋白质-配体复合物的结构稳定性；采用MM/GBSA方法计算结合自由能描述符。

四、研究结果

细胞毒性：MTT实验表明，GC3和GC14在A549和H292细胞中均以浓度依赖性方式降低细胞活力，GC14在两种细胞系中均表现出比GC3更强的细胞毒性，其增强的细胞毒性可能归因于羧酸和羟基官能团。

细胞增殖：在非细胞毒性浓度下，GC3和GC14在较高浓度下显著抑制H292细胞增殖，GC14在50 μM时将增殖降低至对照的约65%，而A549细胞中未观察到显著的抗增殖效应。

细胞迁移：Transwell迁移实验表明，GC3、GC14和GCL在非细胞毒性浓度下均有效抑制肺癌细胞的迁移能力。GC14表现出最强的抗迁移活性，尤其是在A549细胞中，在20 μM时将迁移降低至对照的约25%。

细胞侵袭：Matrigel包被的Transwell侵袭实验表明，GC3、GC14和GCL均有效抑制肺癌细胞的侵袭潜力。GC14通常表现出最强的抗侵袭活性，在20 μM时将A549细胞侵袭降低至对照的约35%，将H292细胞侵袭降低至对照的约30%。

α-葡萄糖苷酶抑制：酶基实验表明，GC14表现出中等抑制活性（IC₅₀ = 140.0 ± 2.32 μM），GCL的IC₅₀为259.5 ± 2.26 μg mL^?1，GC3活性较弱。

分子对接：GC3和GC14均被预测占据所选结合口袋，对接分数范围为?7.5至?9.0 kcal mol^?1。GC3对所有三种蛋白质均产生比GC14更有利的分数，差异为0.7–1.0 kcal mol^?1。

分子动力学模拟：100 ns MD模拟表明，所有六个蛋白质-配体复合物均保持了整体结构稳定性。GC14表现出比GC3更大的内部构象灵活性，但仍在相对狭窄的构象范围内。MM/GBSA分析揭示了靶点依赖的相对能量趋势。

五、讨论与结论

GC14对迁移和侵袭的抑制作用比其直接细胞毒性作用更显著。由于癌症转移占癌症相关死亡的大多数，抑制细胞迁移和侵袭被认为是重要的治疗策略。GC14在非细胞毒性浓度下抑制这些恶性表型的能力表明其生物活性不仅仅是细胞活力降低的结果。两种肺癌细胞系之间观察到差异性反应，GC14在H292细胞中显著抑制增殖，但在A549细胞中效果甚微，这可能反映了遗传背景、生长特性和细胞内信号网络的差异，表明GC14对癌细胞的作用可能具有细胞类型依赖性。

天然存在的3,4-断-木栓烷型三萜极为罕见，迄今仅在Austroplenckia、Phyllanthus和Gymnosporia属的少数物种中报道。来自G. diversifolia的3,4-断-木栓烷-3-酸和来自G. chevalieri的GC14均表现出显著的体外细胞毒性活性，支持进一步研究这一结构类别的生物学特性。

研究结论表明，GCL、GC3和GC14的生物活性提供了初步证据，值得进一步研究其效应，尤其是GC14对癌细胞的选择性。GC14在非细胞毒性浓度下有效抑制肺癌细胞迁移和侵袭，并表现出中等程度的α-葡萄糖苷酶抑制活性。分子对接和MD模拟提供了补充的结构信息，但应视为探索性结构假说而非明确的结合模式归属。确认这些蛋白质为GC3或GC14的直接分子靶标需要专门的机制和靶标验证研究。