生物素–链霉亲和素偶联拓展DNA稳定银纳米簇（DNA-AgNCs）的模块化功能化：保留[Ag16Cl2]8+光学性质的位点特异性生物素化策略

《RSC Advances》：Expanding the conjugation toolbox of DNA-stabilized silver nanoclusters with biotin-streptavidinOpen Access

　　

DNA稳定银纳米簇（DNA-stabilized silver nanoclusters, DNA-AgNCs）兼具分子尺度尺寸与序列依赖性光学性质，使其成为生物成像应用的有前景候选材料。然而，DNA-AgNCs的位点特异性偶联策略仍相对有限。在此，研究人员通过对先前开发的含[Ag₁₆Cl₂]⁸⁺簇的单链DNA-AgNC进行生物素功能化，拓展了DNA-AgNCs的偶联工具箱。将生物素引入3′端或序列中部，可使所得生物素化DNA-AgNCs选择性固定于链霉亲和素包被的聚甲基丙烯酸甲酯（poly(methyl methacrylate, PMMA）微颗粒上。重要的是，生物素功能化及后续颗粒附着在很大程度上保留了DNA-AgNCs的特征光学性质和荧光寿命（fluorescence lifetimes），而对照实验显示非生物素化DNA-AgNCs的非特异性结合可忽略。这些结果表明，生物素–链霉亲和素（biotin–streptavidin）相互作用为DNA-AgNCs的模块化功能化提供了一种稳健策略，且不损害其光物理性质，为其未来整合至生物成像和传感应用提供了机会。

论文解读：该研究围绕DNA稳定银纳米簇（DNA-stabilized silver nanoclusters, DNA-AgNCs；由DNA模板稳定的银原子簇荧光纳米材料）的偶联工具箱拓展展开。研究背景在于，DNA-AgNCs兼具分子尺度尺寸和序列依赖性光学性质，在生物成像等应用中具有吸引力；但DNA-AgNCs的位点特异性偶联策略仍较有限。已有点击化学方法用于高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）纯化的DNA-AgNCs偶联，但未实现纳米簇的单位点功能化，因此需要评估其他成熟生物偶联策略与DNA-AgNCs的兼容性。DNA2-[Ag₁₆Cl₂]⁸⁺因具有解析的原子结构、近红外发射、大Stokes位移和对氯离子的稳定性而受到关注；此前Rück等通过引入胸腺嘧啶间隔，将原始双寡聚体骨架转化为单链类似物，并保持AgNC完整性和光学行为。单链版本为在DNA骨架特定位点引入功能基团提供了条件。生物素–链霉亲和素偶联基于已知最强的非共价相互作用之一，具有超高亲和力、特异性和广泛实验条件兼容性，已用于生物分析、成像和纳米生物技术；但将其引入DNA-AgNCs的尝试有限，且主要使用未纯化、结构未知的DNA-AgNCs。基于此，研究人员在先前单链DNA2-[Ag₁₆Cl₂]⁸⁺基础上引入生物素，构建3′端或胸腺嘧啶区生物素化版本，并以链霉亲和素包被PMMA微球为模型验证选择性固定。该研究的意义在于证明生物素–链霉亲和素偶联可扩展至DNA-AgNCs且不损害其光物理性质，为模块化功能化及后续生物成像和传感整合提供策略。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员基于此前2xDNA(T₄)、2xDNA(T₅)和2xDNA(T₆)-[Ag₁₆Cl₂]⁸⁺单链体系，设计2xDNA(T₆)-B-[Ag₁₆Cl₂]⁸⁺（3′端生物素）和2xDNA(TT-B-TT)-[Ag₁₆Cl₂]⁸⁺（T₅中间胸腺嘧啶替换为生物素化胸腺嘧啶）；以修饰寡聚体合成DNA-AgNCs并经HPLC纯化；采用吸收与发射光谱、荧光衰减和时间分辨荧光各向异性（time-resolved fluorescence anisotropy；用于测定流体力学体积）表征；采用电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS）分析组成；以链霉亲和素包被PMMA微球为模型，结合共聚焦荧光显微、单颗粒发射谱、荧光寿命和对照实验评估选择性固定。本研究未涉及样本队列来源。

研究结果：Synthesis（合成）中，研究人员在前期单链版本基础上设计并合成了两种生物素化DNA-AgNCs，即3′端生物素化2xDNA(T₆)-B-[Ag₁₆Cl₂]⁸⁺和序列中部生物素化2xDNA(TT-B-TT)-[Ag₁₆Cl₂]⁸⁺，经HPLC纯化实现成功分离，结论是两种位点均可用于构建生物素化DNA-AgNCs。Photophysical properties（光物理性质）中，通过光谱表征发现吸收最大值仍约524 nm、发射最大值约750 nm，平均荧光衰减时间与未生物素化版本相似，生物素基团未明显影响光物理性质；时间分辨荧光各向异性显示两种生物素化版本流体力学体积均增加，结论是生物素化基本保留纳米簇特征光学性质并使流体力学体积增大。Compositional analysis（组成分析）中，通过ESI-MS验证组成，实验质量数据包含一条DNA链、两个氯配体和16个银原子（N = 16），N₀=6，符合预期组成；最强峰对应N = 17，作者提出额外银阳离子配位于生物素部分而非[Ag₁₆Cl₂]⁸⁺核心，N = 18小峰可解释为N = 17的Ag⁺加合物，结论是质谱结果支持生物素化后AgNC核心得以保留。Imaging and conjugation verification（成像与偶联验证）中，通过将两种生物素化DNA-AgNCs与9 μm链霉亲和素包被PMMA微球孵育30 min，共聚焦荧光显微显示微球表面均匀荧光，证明两者均成功结合；单颗粒发射谱显示2xDNA(TT-B-TT)-[Ag₁₆Cl₂]⁸⁺发射谱几乎不变，2xDNA(T₆)-B-[Ag₁₆Cl₂]⁸⁺出现小幅蓝移，粒子结合后荧光寿命仅轻微降低；对照实验显示非生物素化2xDNA(T₆)-[Ag₁₆Cl₂]⁸⁺及单独微球自发荧光低，非生物素化DNA-AgNCs无明显非特异性结合，结论是两种生物素化策略均提供有效的链霉亲和素识别和选择性固定。

讨论与结论：讨论部分总结认为，生物素–链霉亲和素偶联可扩展至DNA-AgNCs且不损害其性质；单链版本克服了原始双链版本多官能化位点的问题；链霉亲和素包被PMMA微球是评估特异性结合和标记效率的理想测试平台；两种生物素化版本表现出可比标记行为，为DNA-AgNCs整合入生物系统及作为荧光探针的后续应用提供基础。研究结论（翻译）为：总之，研究表明，先前开发的DNA2-[Ag₁₆Cl₂]⁸⁺单链版本可在3′末端或富含胸腺嘧啶区域引入生物素基团，而不损害纳米簇的结构完整性或光学性质。质谱表征证实两种生物素化版本均保留母体DNA2-[Ag₁₆Cl₂]⁸⁺体系的原子精确组成；单PMMA微球光谱显示偶联和表面附着后发射谱与荧光衰减时间仅有微小变化。链霉亲和素包被PMMA微球是评估特异性结合和标记效率的理想测试平台。2xDNA(T₆)-B-[Ag₁₆Cl₂]⁸⁺与2xDNA(TT-B-TT)-[Ag₁₆Cl₂]⁸⁺表现出可比标记行为，对照实验证实2xDNA(T₆)-[Ag₁₆Cl₂]⁸⁺在链霉亲和素包被表面的非特异性吸附可忽略。综上，这些发现确立生物素–链霉亲和素偶联为扩展DNA-AgNCs生物功能工具箱的有效策略。