新型二苯基吡唑肼-1-甲脒类广谱抗菌先导化合物的合成、表征与活性评价：兼具抗生物膜与毒力调控功能

《RSC Advances》：Synthesis, characterization, and evaluation of novel diphenylpyrazole-based hydrazine-1-carboximidamides as broad-spectrum antibacterial leads with antibiofilm and virulence-modulating activitiesOpen Access

　　

多重耐药（multidrug-resistant, MDR）细菌病原体的出现以及生物膜相关感染的持续蔓延，凸显了开发具有全新化学骨架和互补作用模式的抗菌药物的迫切性。本研究设计、合成并评价了一系列新型二苯基吡唑肼-1-甲脒衍生物（5a–i）作为潜在抗菌及抗生物膜候选分子。目标化合物经三步合成路线获得，包括苯腙形成、Vilsmeier–Haack环化/甲酰化以及随后与氨基胍碳酸氢盐的缩合反应。通过波谱学和质谱技术确立了结构表征。所合成衍生物对代表性革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌表现出差异化的抗菌活性，呈现显著的构效依赖性响应。在该系列化合物中，含硝基苯基取代基的化合物5g脱颖而出，对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）分别为8、4、4和16 μg mL?1。化合物5g在0.5 × MIC浓度下还表现出显著的抗生物膜活性，对相应菌株的抑制率分别为75.95%、53.33%、77.57%和63.73%。时间-杀菌动力学研究证明其对大肠杆菌ATCC 25922具有浓度依赖性和时间依赖性的杀菌效应，而钾离子渗漏实验和扫描电子显微镜提供了细菌膜扰动和细胞包膜损伤的互补性证据。此外，化合物5g对铜绿假单胞菌表现出良好的抗群体感应（anti-quorum-sensing, anti-QS）活性，在?和? MIC浓度下分别使绿脓菌素产量显著降低26.80%和54.33%。重要的是，5g对WI-38正常人细胞表现出低细胞毒性（半数抑制浓度IC50 = 255 ± 22.1 μg mL?1），且选择性指数（selectivity index, SI）高达32。综上，这些发现将二苯基吡唑甲脒类化合物5g确认为一种具有直接抗菌、抗生物膜、膜扰动和抗群体感应等多重功能的有前景的抗菌先导化合物，值得进一步的结构优化和机制研究。

论文解读

一、研究背景与研究目的

多重耐药（multidrug-resistant, MDR）细菌病原体的快速蔓延已成为全球重大公共卫生威胁，严重削弱了现有抗生素的临床疗效。细菌耐药性可通过多种机制产生，包括酶促药物失活、靶点修饰、膜通透性改变和主动外排等。更为棘手的是，生物膜的形成进一步加剧了感染治疗的难度——生物膜内细菌被胞外基质包裹，形成结构化群落，可有效抵御抗菌药物和宿主免疫系统的攻击，导致感染持续存在、难以根除且易于复发。与此同时，群体感应（quorum sensing, QS）作为细菌密度依赖性的通讯系统，在调控生物膜发育和多种毒力因子表达中发挥关键作用。在铜绿假单胞菌中，QS系统控制着绿脓菌素、鼠李糖脂等重要毒力相关代谢产物的产生。因此，同时靶向细菌生长、生物膜形成和QS调控的毒力表达，代表了开发多功能抗菌药物的重要策略。

在含氮杂环骨架中，吡唑因其结构多样性、良好的药理特性和对不同取代基的容纳能力而备受药物化学领域关注。特别是二苯基吡唑衍生物，其吡唑环与两个芳香环相连，提供了延展的疏水表面和显著的结构刚性，可能有利于膜渗透和增强与生物靶点的疏水相互作用。然而，过高的亲脂性可能对水溶性和药代动力学行为产生不利影响。因此，将二苯基吡唑核心与极性的氨基胍/甲脒官能团相结合，是引入氢键能力和增加极性、同时保留芳香骨架有利疏水贡献的合理策略。

基于此，研究人员以苯基噻唑、苯基吡唑和苯基三唑类抗菌剂的生物活性特征为指导，选择二苯基吡唑核心以利用其芳香性、构象刚性和疏水/π介导相互作用的潜力，并引入氨基胍/甲脒部分以增强极性和氢键能力。该设计还考虑了靶向十一异戊二烯焦磷酸合成酶（undecaprenyl pyrophosphate synthase, UPPS）和十一异戊二烯焦磷酸磷酸酶（undecaprenyl pyrophosphate phosphatase, UPP）的潜在可能——这两种酶参与十一异戊二烯磷酸代谢和细菌细胞壁生物合成。研究人员系统变化芳基取代基以探索构效关系，旨在获得抗菌活性、靶点互补性、理化性质和药代动力学优势的平衡组合。

二、关键研究方法

研究人员采用三步合成路线制备目标化合物：首先将苯肼与取代苯乙酮缩合得到苯腙中间体；随后经Vilsmeier–Haack环化/甲酰化反应生成1-苯基-3-取代-1H-吡唑-4-甲醛关键中间体；最后与氨基胍碳酸氢盐在乙醇中缩合得到目标化合物5a–i。抗菌活性采用琼脂孔扩散法和微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）及半数抑制浓度（MIC₅₀）；抗生物膜活性采用结晶紫染色法在0.5 × MIC浓度下评价；杀菌动力学通过时间-杀菌曲线测定；膜完整性通过钾离子渗漏实验和扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）评价；抗群体感应活性通过检测绿脓菌素产量变化评估；细胞毒性采用WI-38正常人肺成纤维细胞系进行MTT法测定；分子对接研究针对UPPS靶点（PDB ID: 1V7U）开展。

三、研究结果

3.1 化学合成与结构表征

目标化合物5a–i通过三步合成路线高效获得。该路线的一大优势在于起始苯乙酮中的取代基保留在吡唑环C-3位，可在相似反应条件下制备结构多样的系列化合物。最终产物因芳基或杂芳基取代基的性质而区分：5a含未取代苯基；5b–d含对位卤素取代基（Br、Cl、F）；5e和5f分别含供电子甲基和甲氧基；5g含强吸电子硝基；5h含扩展萘环体系；5i含噻吩环。波谱学特征证实了目标化合物的形成，包括醛基质子消失、甲亚胺（CH=N）质子出现以及NH和NH₂信号。

3.2 体外抗菌活性与构效关系

琼脂孔扩散实验显示，所有化合物5a–i均对测试微生物产生可测量的抑菌圈，但活性差异显著。化合物5g（对硝基苯基取代）表现出最突出的广谱活性，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌圈分别为27.33 ± 1.15、25.00 ± 0.00、29.33 ± 0.58和19.33 ± 0.58 mm。值得注意的是，5g对大肠杆菌的抑菌圈与多黏菌素（29.33 ± 0.58 mm）完全一致，对金黄色葡萄球菌的活性接近万古霉素（32.00 ± 0.00 mm）。化合物5b（对溴苯基取代）也表现出较强的广谱活性，尤其对枯草芽孢杆菌的抑菌圈达30.33 ± 1.15 mm。

MIC测定进一步确认了5g为该系列的最优化合物，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的MIC值分别为8、4、4和16 μg mL^?1，MIC₅₀分别为4.43、2.58、2.18和9.06 μg mL^?1。化合物5b也表现出广谱且有效的活性，MIC值为8 μg mL^?1（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌）和16 μg mL^?1（铜绿假单胞菌）。构效关系分析表明，NO₂和Br取代提供了最有利的活性模式，而Cl、F以及过度的芳香环扩展通常不利于抗菌活性。

3.3 抗生物膜活性

在0.5 × MIC浓度下，化合物5g对四种测试菌株的生物膜形成均表现出显著抑制。对大肠杆菌的抑制率最高，达77.57 ± 3.67%，其次为金黄色葡萄球菌（75.95 ± 3.09%）、铜绿假单胞菌（63.73 ± 2.11%）和枯草芽孢杆菌（53.33 ± 2.85%）。与参考抗生素相比，5g对大肠杆菌的抑制率高于多黏菌素（62.21 ± 3.43%），对枯草芽孢杆菌的抑制率高于万古霉素（39.97 ± 2.05%）。由于实验在亚抑菌浓度下进行，这些结果表明5g可能干扰生物膜相关过程，如初始黏附、胞外聚合物产生或生物膜成熟，而非简单消除浮游细胞。

3.4 时间依赖性杀菌活性

时间-杀菌实验表明，化合物5g对大肠杆菌ATCC 25922表现出浓度和时间依赖性的杀菌效应。在2 × MIC浓度下，活菌数从初始5.61 log₁₀ CFU mL^?1逐步降至2、4、6、8 h后的4.78 ± 0.07、3.97 ± 0.05、3.59 ± 0.05和2.60 ± 0.02 log₁₀ CFU mL^?1，24 h后降至检测限以下。在4 × MIC浓度下杀菌更为迅速，2、4、6、8 h后活菌数分别降至4.02 ± 0.08、3.33 ± 0.08、2.44 ± 0.08和0.97 ± 0.08 log₁₀ CFU mL^?1，24 h后完全消除且无再生长。

3.5 膜完整性影响

钾离子渗漏实验提供了膜损伤的生化证据。经5g处理后，大肠杆菌的胞外K⁺浓度从11.76 ± 1.06增至70.46 ± 0.71 μg mL^?1，为对照的5.99倍；金黄色葡萄球菌从15.91 ± 0.59增至68.82 ± 1.90 μg mL^?1（4.32倍）；枯草芽孢杆菌从20.44 ± 1.05增至75.94 ± 0.95 μg mL^?1（3.72倍）；铜绿假单胞菌从23.22 ± 0.94增至36.50 ± 0.80 μg mL^?1（1.57倍）。SEM观察进一步证实，经5g处理的大肠杆菌细胞出现表面粗糙化、变形、皱缩和细胞包膜明显破坏等形态学异常，而未经处理的对照细胞保持规则杆状形态和光滑完整表面。

3.6 抗群体感应活性

化合物5g在亚抑菌浓度下对铜绿假单胞菌的绿脓菌素产量表现出浓度依赖性抑制。在? MIC浓度下，绿脓菌素产量从对照的13.86 ± 0.43 μg mL^?1降至10.14 ± 0.36 μg mL^?1，抑制率为26.80%（p = 0.012）；在? MIC浓度下进一步降至6.33 ± 0.31 μg mL^?1，抑制率达54.33%（p < 0.001）。这一抗毒力效应在不直接靶向细菌存活力的前提下实现，可能通过降低耐药选择压力而具有治疗优势。

3.7 细胞毒性与安全性评价

化合物5a–i对WI-38正常人肺成纤维细胞的IC₅₀值范围为65至255 μg mL^?1。化合物5g表现出最优的安全性特征，IC₅₀为255 ± 22.1 μg mL^?1，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的选择性指数（selectivity index, SI）分别达32和64，优于万古霉素对金黄色葡萄球菌的SI值26。化合物5b和5c也表现出较优的选择性特征。

3.8 分子对接研究

分子对接分析显示，化合物5g在UPPS（PDB ID: 1V7U）底物结合腔中呈现有利的结合取向。其富含氮的胍/脒末端定位于UPPS活性位点的极性区域，而苯基-吡唑骨架延伸至结合腔的疏水部分。关键的相互作用包括：胍/脒氮原子与Asp26形成两个氢键（距离2.96和3.05 ?，能量分别为?8.8和?5.6 kcal mol^?1），同时伴随离子相互作用（?4.7和?4.2 kcal mol^?1）；含氧取代基与Ser71形成氢键受体相互作用（距离2.91 ?，能量?0.7 kcal mol^?1）；以及与结晶水分子HOH 687的弱相互作用（距离3.08 ?，能量?1.1 kcal mol^?1）。预测结合自由能ΔG为?8.16 kcal mol^?1，抑制常数K_i为1.04 μM。

四、讨论与结论

本研究通过合理的药效团设计策略，成功开发了一系列新型二苯基吡唑肼-1-甲脒衍生物。构效关系分析表明，取代基的电子特性和物理化学性质对抗菌活性具有决定性影响，其中NO₂和Br提供了最有利的取代模式。化合物5g凭借其广谱抗菌、抗生物膜、膜扰动和抗群体感应的多重功能，以及良好的细胞安全性和选择性指数，被确认为该系列中最有前景的先导化合物。其作用机制涉及细菌膜完整性的破坏和QS调控的毒力因子表达抑制，分子对接结果也支持其与UPPS靶点的合理结合模式。这些发现为二苯基吡唑甲脒类化合物作为新型多功能抗菌先导物的进一步结构优化和机制研究奠定了坚实基础，也为应对多重耐药菌和生物膜相关感染提供了新的候选分子框架。