市政污泥/激光诱导石墨烯纳米酶结合机器学习辅助智能手机比色传感检测四环素

《RSC Advances》：Municipal wastewater sludge/laser-induced graphene nanozyme for machine-learning-assisted smartphone colorimetric tetracycline sensingOpen Access

　　

市政污泥（Municipal Wastewater Sludge, MWS）是一种富含铁的废弃物流，具有作为功能性催化材料进行资源化利用的巨大潜力。本研究将富铁MWS衍生相与聚酰亚胺衍生的激光诱导石墨烯（Laser-Induced Graphene, LIG）相结合，构建了一种用于四环素（Tetracycline, TC）传感的多功能LIG/MWS复合纳米酶。LIG通过低成本450 nm二极管激光直接制备，MWS则通过混凝-絮凝、煅烧、酸洗和干燥回收。优化后的LIG/MWS复合物对TMB–H2O2体系表现出增强的过氧化物酶样活性，其中TC通过与含铁催化位点的相互作用抑制颜色显色。所提出的比色测定法可在0–50 μM范围内测定TC，检测限为0.70 μM，R2 = 0.9866。该传感策略进一步转化为智能手机可读的纸基分析装置（Paper-based Analytical Device, PAD），基于RGB的校准提供了便携式TC筛查能力。与此同时，研究人员使用主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）和监督机器学习分析了一个独立的96孔智能手机成像数据集，以评估多变量浓度预测和采集条件变异性。PCA显示前两个主成分解释了97.10%的RGB方差，而光照被确定为系统变异的主要来源。在偏最小二乘回归（PLSR）、支持向量回归（SVR）、随机森林（Random Forest, RF）、极端梯度提升（XGBoost）和人工神经网络（Artificial Neural Network, ANN）模型中，ANN在嵌套分组交叉验证中取得了最佳性能（R2 = 0.987，RMSE = 6.95 μM），而留一条件验证表明室外光照是模型泛化的主要限制。LIG/MWS复合物还表现出次级亚甲基蓝吸附能力，凸显了其多功能潜力。这项工作提供了一个可持续的纳米酶平台，整合了废弃物资源化、智能手机辅助传感和机器学习辅助比色分析。

一、研究背景与科学问题

四环素（Tetracycline, TC）作为人类医学、畜牧业和水产养殖中应用最广泛的广谱抗生素之一，因其价格低廉和抗菌谱广而被大量使用。由于大部分TC以未代谢形式排出体外，其残留物持续进入市政污水和地表水，凭借其难生物降解性和稳定性造成持久性环境污染。除直接生态毒理效应外，亚致死浓度TC暴露还与抗生素抗性基因的产生和传播密切相关，构成日益严重的全球公共卫生威胁。值得注意的是，TC含有多个氧供体官能团（二酮和酚羟基），易于与铁和铝氧化物表面配位，这一特性不仅决定其环境归趋，也是本研究传感策略的核心机制基础。

现有TC检测方法包括基于碳点或量子点的荧光探针、修饰电极电化学传感器和比色测定法等，虽具良好灵敏度，但多依赖精密仪器、复杂电极或探针制备、分析时间较长，限制了在资源有限环境中快速、现场、低成本筛查的应用。纳米酶作为模拟天然酶催化功能的新型纳米材料，因成本低、稳定性高、易规模化生产而成为传统酶学检测的有力替代方案。其中铁基纳米酶尤为引人关注，其类芬顿氧化还原活性可被与表面铁位点配位的分析物调控，而TC的强铁螯合能力恰好适用这一机制。

然而，纳米酶传感器实际部署的关键挑战在于合成纳米材料通常需要昂贵前体和多步化学合成。市政污泥（Municipal Wastewater Sludge, MWS）作为污水处理厂大量产生的副产物，因混凝-絮凝处理常采用铁基混凝剂而天然富集含铁矿物相，具有内在过氧化物酶模拟潜力。激光诱导石墨烯（Laser-Induced Graphene, LIG）则提供高导电、三维多孔碳框架，可通过单步无掩模工艺直接在聚合物前体上制备，且低成本450 nm二极管激光已证明可通过与CO₂激光相同的光热石墨化机制产生导电LIG。

基于此，研究人员将MWS与LIG结合为多功能复合纳米酶：MWS的富铁矿物域提供H₂O₂活化催化中心，LIG互连多孔框架促进活性相分散和底物可及性。TC通过含氧官能团与复合物催化位点相互作用抑制TMB氧化，转化为浓度依赖性比色响应。为将传感化学推向现场分析，该纳米酶被集成至纸基分析装置（Paper-based Analytical Device, PAD），实现肉眼观察和智能手机RGB读取。同时，独立96孔智能手机成像实验结合主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）和监督回归模型，系统考察多通道颜色描述符在可变采集条件下定量预测TC的可行性。

二、研究目标

本研究旨在：（i）制备含铁MWS/LIG复合纳米酶并优化其过氧化物酶模拟活性；（ii）建立TMB–H₂O₂比色体系对TC测定的抑制机制和分析性能；（iii）将传感化学转化为智能手机可读PAD并评估便携式TC筛查适用性；（iv）利用96孔成像、PCA和监督机器学习独立研究多变量智能手机RGB响应，重点关注采集条件变异性和模型泛化；（v）展示复合物对亚甲基蓝（Methylene Blue, MB）的次级吸附功能。加标自来水与牛奶用于评估紫外-可见和PAD格式的实际样品适用性。

三、关键技术方法

研究人员采用以下主要技术方法开展研究：利用Daja DJ6激光雕刻机配备450 nm蓝色二极管激光在聚酰亚胺薄膜上直接制备LIG；通过混凝-絮凝（以Fe(NO₃)₃·9H₂O为混凝剂）、离心、干燥、球磨过筛、500 °C马弗炉煅烧、1 M HCl酸洗和再次干燥回收MWS；采用超声辅助物理共混制备不同质量比（9:1、1:1、1:9）的LIG/MWS复合物；通过AutoCAD 2026设计并经激光雕刻制备PAD；利用紫外-可见分光光度计（Jasco V670）评估过氧化物酶样活性；采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）、扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）和X射线光电子能谱（XPS）进行材料表征；使用智能手机采集图像并经ImageJ提取RGB值；采用PCA和五种监督回归模型（偏最小二乘回归PLSR、支持向量回归SVR、随机森林RF、XGBoost、人工神经网络ANN）进行多变量数据分析，采用嵌套分组交叉验证和留一采集块验证评估模型性能。

四、研究结果

4.1 材料表征结果

TEM观察表明，二极管激光制备的LIG由褶皱、互连、乱层石墨网络构成，包含纤维状和折叠片状域，而非有序石墨晶格。高分辨率图像显示不规则曲率、中断连续性的波浪状晶格条纹，呈现无序乱层堆叠，属LIG激光诱导光热石墨化的典型结构特征，提供丰富边缘和缺陷位点用于电子转移和分子吸附。

SEM分析显示，原始MWS呈不规则致密团聚体，由较小熔融颗粒和不规则域组成；LIG呈松散堆积、互连的片状结构，具较薄重叠折叠碳片和片间空隙；复合物中MWS衍生颗粒域分布于LIG片层框架之间，形成异质且较不致密结构，表明两组分有效物理整合。

FTIR光谱确认MWS含表面羟基、芳香C=C、C-O/C-N振动及Fe-O振动（约529 cm^?1）；LIG保留聚酰亚胺前体残留不饱和及含氮物种特征；复合物保留两组分特征谱带，Fe-O带持续存在表明含铁矿物相在复合后得以保留，形成以物理整合为主的复合结构。

XRD显示LIG在2θ = 24–26°呈现宽衍射特征，对应乱层石墨碳（002）反射；MWS呈现宽背景叠加若干尖锐反射，反映无定形与结晶相共存；复合物同时保留LIG宽碳特征和MWS矿物相关反射，证实两组分结构均得以保留。

XPS宽谱扫描证实LIG/MWS复合物中额外出现Fe2p峰（约711 eV）和Na1s峰（约1071 eV），直接证明源自混凝-絮凝MWS的含铁无机相成功保留并均匀掺入复合物，Na来源于市政污泥水相中天然溶解钠离子。

4.2 过氧化物酶样活性与TC检测性能

通过TMB–H₂O₂比色体系评估不同LIG/MWS质量比复合物的过氧化物酶样活性，优化后1:1复合物表现出增强催化活性。TC通过与含铁催化位点相互作用抑制TMB氧化显色，实现0–50 μM范围内TC测定，检测限0.70 μM，R² = 0.9866。系统优化了pH（2–8）、TMB浓度（100–500 μM）、H₂O₂体积（10–70 μL）和温度等反应参数。选择性实验比较五种抗生素（阿莫西林、金霉素盐酸盐、TC、氯霉素和磺胺甲噁唑），验证了传感平台对TC的特异性响应。稳定性实验表明纳米酶在28天储存期间保持催化性能；重复性实验（0和10 μM TC）计算RSD评估精密度；再现性实验比较独立合成批次验证制备一致性。

4.3 PAD便携式检测

将传感化学转化为智能手机可读PAD，采用中央反应区连接五个外围检测区的径向微通道设计，定性滤纸（孔径15–20 μm）为基底，经激光雕刻制备。不同TC浓度产生对应蓝色强度，智能手机拍摄后经ImageJ提取RGB值实现定量分析。加标自来水和商业牛奶样品经0.2%（v/v）稀释后验证实际样品适用性。

4.4 多变量RGB分析与机器学习

独立96孔智能手机成像实验系统考察智能手机型号、光照条件、成像角度和相机-样品距离对RGB响应的影响。PCA使用六个非冗余描述符（R、G、B、ΔR、ΔG、ΔB），前两个主成分解释97.10%的RGB方差，光照被确定为主导系统变异来源。五种监督回归模型（PLSR、SVR、RF、XGBoost、ANN）采用嵌套分组交叉验证评估，ANN取得最佳性能（R² = 0.987，RMSE = 6.95 μM）。留一采集块验证表明室外光照是模型泛化的主要限制因素。留一浓度水平分析作为插值能力的探索性测试。

4.5 MB吸附

作为材料多功能性的次级验证，LIG/MWS复合物对MB表现出吸附能力，利用多孔石墨框架和异质表面化学实现污染物去除概念验证，吸附容量按初始与平衡浓度差计算。

五、讨论与结论

讨论部分指出，LIG/MWS复合物通过MWS提供催化活性位点与LIG提供导电多孔框架的协同作用实现增强过氧化物酶活性。TC的抑制机制归因于其含氧官能团与复合物表面铁位点的配位作用。多变量机器学习分析表明，虽然ANN在分组验证中表现优异，但室外光照条件对模型跨条件泛化构成主要挑战，提示实际应用中需控制或校正光照条件。PAD格式为现场快速筛查提供了便携方案，而MB吸附功能拓展了材料的多元化应用前景。

研究结论表明，该工作成功构建了整合废弃物资源化、智能手机辅助传感和机器学习辅助比色分析的可持续纳米酶平台。LIG/MWS复合纳米酶实现了TC的灵敏比色检测，PAD转化提供了便携式筛查能力，机器学习分析为多变量颜色响应定量预测提供了有效途径，次级MB吸附展示了材料多功能潜力。该研究为市政污泥的高附加值资源化利用和抗生素现场检测提供了创新集成方案。