云芝、猴头菇与平菇蘑菇生物质的生化表征：生物活性谱分析、LC–MS/MS指纹图谱、抗氧化能力及对人微胶质细胞（HMC3）中ROS的抑制作用

《Journal of Food Composition and Analysis》：Biochemical characterization of Trametes versicolor, Hericium erinaceus, and Pleurotus ostreatus mushroom biomass: bioactive profiling, LC–MS/MS fingerprinting, antioxidant capacity, and ROS inhibition in human microglial cells (HMC3)

　　

蘑菇生物质（MB）因其丰富的营养与生物活性成分，被视为新一代食品，在功能性食品、营养保健品及药物开发中具有可持续应用前景。其中，云芝（Trametes versicolor，TV）与猴头菇（Hericium erinaceus，HE）因其神经保护潜力而备受关注；平菇（Pleurotus ostreatus，PO）则作为具有商业化相关性但生物活性潜力尚未充分探索的食用菌种纳入比较。以往研究多聚焦于子实体多糖组分，且未对非多糖组分中的其他关键生物活性化合物进行系统定量，亦未探究其抗氧化及活性氧（ROS）调节效应，因此这些蘑菇生物质详细生化组成与其抗氧化活性及ROS调节活性之间的关系仍存在关键空白。本研究旨在对TV、HE与PO蘑菇生物质中的关键生物活性化合物进行定量，包括γ-氨基丁酸（GABA）、麦角甾醇、生育酚、抗坏血酸、硒、锌、类胡萝卜素、有机酸、酚类化合物（如酚酸及糖基化酚酸）、脂肪酸衍生物及其他代谢物（如hericenal A），并采用ABTS（2,2-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）、DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）、ORAC（氧自由基吸收能力）与FRAP（铁还原抗氧化能力）体外试验评估其抗氧化特性。此外，通过测定其降低微胶质细胞系ROS产生的能力，对表征所得的生物活性谱进行功能验证。本研究首次对这三种蘑菇生物质的非多糖生物活性组分进行系统比较生化表征，为其作为功能性可持续食品配料的潜在应用提供了新见解。

研究背景方面，蘑菇因富含多糖、蛋白质、萜类、甾体、多酚、维生素等生物分子，具有抗氧化、免疫调节、抗炎及神经保护等多种健康促进作用，被视为新一代食品。在众多菌种中，TV与HE因神经保护潜力受到特别关注：TV生物质补充可提高小鼠海马神经元中β-catenin水平并改善认知储备；TV与HE补充可提高大鼠脑内溶血磷脂酸4（LPA4）表达；两者联用可促进大脑细胞应激反应及脂氧素A4（LXA4）表达；在鱼藤酮诱导的帕金森病小鼠模型中，HE与TV生物质可显著改善神经炎症及运动与非运动症状。然而，既往研究多聚焦于子实体多糖组分，虽日益有证据表明菌丝体与子实体中多种大分子间可能存在协同相互作用，但此前对这三种蘑菇生物质的分析仅揭示其高营养值（总葡聚糖76.15–80.45% DW，以(1→4)-α-葡聚糖为主），其消化组分与肠道菌群代谢物的神经保护潜力虽已在人微胶质细胞（HMC3）及转基因秀丽隐杆线虫模型中证实，但尚未全面定量非多糖组分中的其他关键生物活性化合物，亦未研究其抗氧化与ROS调节效应。过量ROS可损伤DNA、蛋白质与脂质，氧化应激在衰老及阿尔茨海默病等神经退行性疾病中发挥重要作用。因此，本研究旨在表征具有抗氧化特性的相关生物活性化合物，并在人微胶质细胞模型中评估其抗氧化与ROS调节活性。研究对TV、HE与PO生物质中的GABA、麦角甾醇、生育酚、抗坏血酸、硒、锌、类胡萝卜素、有机酸、酚类化合物、脂肪酸衍生物及其他代谢物进行定量，采用ABTS、DPPH、ORAC与FRAP试验评估抗氧化特性，并通过HMC3细胞系测定其降低ROS产生的能力进行功能验证。结果表明，三种生物质呈现物种特异性生化谱：TV在GABA、麦角甾醇、抗坏血酸、类胡萝卜素及游离酚类化合物（FPC）含量上更高；HE生育酚含量突出，尤其是α-与γ-生育酚；三种物种硒含量相似，PO锌含量更高。LC-ESI-UHR-QqTOF-MS分析实现了多种酚类化合物的初步注释，判别分析显示HE与PO以黄酮类与肉桂酸型糖苷为特征，TV以糖基化脂肪酸为特征。所有物种在特定浓度下均可降低HMC3细胞内ROS产生，最高达21%。本研究的意义在于首次对这三种蘑菇生物质的非多糖生物活性组分进行系统比较生化表征，凸显其作为具有氧化应激相关研究潜力生物活性化合物来源的价值，为其作为功能性可持续食品配料的潜在应用奠定基础。

关键技术方法方面，研究采用同一批干燥粉碎的TV、HE与PO蘑菇生物质（粒径250–500 μm，由Mycology Research Laboratories Ltd与Aneid-Produtos Farmacêuticos Lda提供，生产符合ISO 22000:2018食品安全认证）；采用高效液相色谱（HPLC）结合荧光检测定量GABA与生育酚，HPLC-二极管阵列检测定量抗坏血酸，HPLC定量麦角甾醇，分光光度法测定总类胡萝卜素，Folin–Ciocalteu法测定总酚含量（TPC）；采用液相色谱-电喷雾电离-超高分辨四极杆飞行时间质谱（LC-ESI-UHR-QqTOF-MS）进行代谢组学指纹图谱分析并结合sPLS-DA多变量统计；采用ABTS、DPPH、ORAC与FRAP四种体外抗氧化试验；以人微胶质细胞（HMC3）系进行细胞活力（PrestoBlue法）与ROS产生（DCFH-DA探针，TBHP诱导氧化应激）评估。

研究结果方面，3.1蘑菇生物质的化学组成：基于既往对同一批次生物质的表征，碳水化合物为主要成分（91.49–93.05% DW），蛋白质4.08–6.28% DW，TV碳水化合物最低、蛋白质最高；灰分与脂肪在物种间差异显著，TV灰分最高、HE脂肪最高；总葡聚糖76.15–80.45% DW，无显著差异，以α-葡聚糖及其他连接β-葡聚糖为主（71.49–77.49% DW），核磁共振与糖苷键分析显示以(1→4)-α-葡聚糖为主。这些差异主要归因于基质组成、栽培方式及子实体与菌丝体化学组成的固有差异。3.2蘑菇生物质的生物活性化合物：TV的GABA含量（125.99 mg/100 g DW）显著高于HE与PO（77.62与80.26 mg/100 g DW）；麦角甾醇以TV最高（8.97 mg/100 g），PO次之（5.20），HE最低（1.57）；HE所有生育酚异构体含量最高，总生育酚达816.74 μg/100 g DW，α-与γ-生育酚在所有物种中最为丰富；总类胡萝卜素以TV最高（18.05 mg/100 g DW），HE次之（9.27），PO最低（5.67）；抗坏血酸以TV显著最高（3.31 mg/100 g DW），HE与PO无显著差异；硒含量在三种物种间无显著差异（87.68–93.04 μg/100 g DW）；锌含量PO最高、TV最低。TPC方面，TV与PO的FPC显著高于结合酚类化合物（BPC），TV的FPC最高（113.31 mg GAE/100 g DW），PO（54.38）高于HE（20.78）；HE与PO的BPC无显著差异。LC-ESI-UHR-QqTOF-MS分析实现了酚类化合物（如酚酸与糖基化酚酸）及其他化合物（如有机酸、糖苷、脂肪酸衍生物）的初步注释，检出肉桂酸、咖啡酸、香草酸、没食子酸等常见酚酸及海藻糖、苹果酸、柠檬酸等丰度较高代谢物；sPLS-DA得分图清晰区分三个物种（组分1占42.2%，组分2占40.2%），载荷图显示m/z 255.1598、443.1919、461.1301贡献于载荷1，m/z 477.1247、167.0355关联载荷2；层次聚类热图显示PO与TV聚为一类（同属白腐真菌），HE形成独立簇。总体而言，TV以GABA、麦角甾醇、抗坏血酸、类胡萝卜素、FPC、有机酸及糖基化脂肪酸类化合物含量较高为特征，HE以生育酚（尤其α-与γ-生育酚）、香草酸及黄酮类糖苷为特征，PO以锌含量较高为特征，三种物种硒含量相似。3.3蘑菇生物质总抗氧化活性评估：在所有抗氧化试验中，TV的FPC组分抗氧化活性显著最高（ABTS：69.59 mg TE/100 g DW；DPPH：25.43；ORAC：208.27；FRAP：183.63 mg ISHE/100 g DW），与其较高的TPC一致；ABTS、DPPH与ORAC试验中HE与PO的FPC无显著差异，FRAP试验中HE显著高于PO；BPC组分中，TV与HE在DPPH与FRAP试验中显著高于PO，ABTS试验中HE最高，ORAC试验中三种物种无显著差异。不同试验反映不同抗氧化机制（氢原子转移、电子转移或二者兼有），互补使用可更全面评估抗氧化能力。3.4基于HMC3细胞系的神经元细胞试验：细胞活力方面，5 mg/mL浓度下TV与PO细胞活力低于70%（67.77–68.47%），HE为74.23%；2.5 mg/mL下HE与PO细胞活力显著较高（96.89与97.75%），TV在2.5与1.25 mg/mL间无显著差异；所有物种0.63 mg/mL均出现活力下降，提示浓度是HMC3调节的相关参数，据此选择2.5、1.25与0.63 mg/mL进行ROS试验。抗氧化应激保护方面，2.5 mg/mL TV对ROS抑制呈负面影响，提示该浓度可能增加氧化应激；HE在1.25与0.63 mg/mL间ROS抑制无显著差异（19.80–21.29%），TV类似（15.47–19.71%），PO在1.25 mg/mL时ROS抑制最高（15.35%）。结果表明生物质以物种与浓度依赖方式调节HMC3细胞内ROS产生，低浓度HE与PO（0.63与1.25 mg/mL）及较低浓度TV效果更明显；这些细胞效应与化学试验测得的抗氧化能力一致，但本研究数据未建立化学抗氧化能力与细胞内ROS调节之间的直接关系。既往研究中同批次生物质的模拟消化组分在0.63–2.5 mg/mL下可显著抑制TBHP诱导的HMC3细胞ROS产生（20–24%），且高浓度未见促氧化效应，提示胃肠消化可能改变生物活性组成并调节完整生物质所观察到的浓度依赖性抗氧化行为。3.5研究局限与未来展望：本研究旨在表征生物质而非评价分离化合物，故无法确定单个代谢物对观察到的抗氧化及细胞内ROS调节效应的贡献，但该方式更全面反映生物质作为食品基质的生化复杂性；LC–MS/MS部分缺乏混合质控样本，判别特征未经标准品验证，仅为MSI 2级或3级初步注释，且仅分析三个物种的单批次生物质、重复为分析重复而非生物学重复，故未进行与抗氧化响应的相关性分析；未来应纳入混合质控样本、独立生物质批次及标准品验证。三种生物质虽在特定浓度下均降低细胞内ROS产生，但应解释为细胞内ROS调节活性的证据而非神经保护作用的直接证据；(1→4)-α-葡聚糖、GABA、麦角甾醇及酚类化合物的存在与既往报道的抗氧化及神经保护特性一致，但其个体贡献及代谢物丰度与生物响应间的因果关系尚不能推断，需进一步评估神经元功能、炎症反应及相关分子通路。未来应研究生物活性化合物的生物可及性与生物利用度，纳入模拟胃肠消化、生物可及性评估及肠道吸收模型以确立生理相关性；HMC3作为永生化细胞系与人微胶质细胞在表型与复杂性上存在差异，需跨模型验证并将结果外推至原代人微胶质细胞与体内脑环境时保持谨慎；本研究聚焦细胞内ROS产生，未评估补充炎症生物标志物或直接研究相关信号通路，需进一步体外与体内神经元研究探究NF-κB与Nrf2等信号通路及补充炎症标志物，以确定这些效应是否转化为有意义的神经保护活性。结论部分译文：本研究拓展了既往对这些生物质的化学表征，提供了TV、HE与PO生物质的全面生物活性表征及体外抗氧化活性与细胞内ROS调节潜力，凸显这些物种作为具有氧化应激相关研究潜力独特生物活性化合物来源的价值。既往化学组成分析与本研究的生化表征均凸显物种特异性生化谱，与文献报道的蘑菇化学与生物活性化合物高度变异性一致。TV在GABA、麦角甾醇、抗坏血酸、类胡萝卜素及FPC含量上更高，HE生育酚含量突出（尤其α-与γ-生育酚），三种物种硒含量相似，PO锌含量更高。LC-ESI-UHR-QqTOF-MS谱分析实现了蘑菇提取物中多种酚类化合物的初步注释，揭示常见酚酸（如肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、香草酸）及物种特异性糖基化衍生物与其他生物活性特征；判别分析凸显HE与PO中的黄酮类与肉桂酸型糖苷及TV中的糖基化脂肪酸。这些发现强调各物种的代谢多样性，为进一步研究构效关系及这些代谢物（单独或联合）对抗氧化与神经保护机制的潜在功能相关性奠定基础。