《Journal of Food Composition and Analysis》：Rapid Untargeted Volatile Organic Compound Profiling and Putative Identification of Cypriot Multifloral Honeys Using Proton Transfer Reaction-Quadrupole interface-Time of Flight-Mass Spectrometry
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本研究旨在评估质子转移反应-四极杆接口-飞行时间质谱（PTR-Qi-TOF-MS）作为一种快速分析工具，基于非靶向挥发性指纹图谱表征塞浦路斯多花蜂蜜的有效性，并为源自异质性地中海生境的蜂蜜化学复杂性提供新见解。研究人员于2023年5月至10月期间从北塞浦路斯六
本研究旨在评估质子转移反应-四极杆接口-飞行时间质谱（PTR-Qi-TOF-MS）作为一种快速分析工具，基于非靶向挥发性指纹图谱表征塞浦路斯多花蜂蜜的有效性，并为源自异质性地中海生境的蜂蜜化学复杂性提供新见解。研究人员于2023年5月至10月期间从北塞浦路斯六个地区（尼科西亚、凯里尼亚、法马古斯塔、特里科莫、莫尔富和莱夫卡）的61个不同地点采集了74份蜂蜜样品。采用直接顶空PTR-Qi-TOF-MS技术在m/z 20–300范围内获取全扫描质谱图，依据代谢组学标准倡议（MSI）报告标准，所有挥发性有机化合物（VOC）归属均为Level 3暂定（推定）鉴定，仅接受质量精度≤10 ppm的归属。原始数据经ptairMS软件包预处理，包括质量轴校准、峰检测、基线去除及噪声阈值处理，并手动排除污染物、离子源化学相关离子、负质量亏损离子及水簇离子。采用基于马氏距离的自动化离群值检测方案（卡方分布第97.5百分位阈值，p < 0.05）进行客观样本筛选。为避免伪重复，技术重复在统计分析前进行聚合。数据经log10转换和自动缩放后，进行主成分分析（PCA）、无监督K-means聚类分析（结合肘部法则和轮廓分析确定最优聚类数）、单因素方差分析（ANOVA）配合Benjamini–Hochberg错误发现率（FDR）校正（q < 0.05）及Tukey氏诚实显著性差异（HSD）事后检验（p < 0.05），并生成层次聚类热图。采用Fisher精确检验（蒙特卡洛模拟，2000次重复）和Kruskal–Wallis检验评估聚类归属与样本元数据（生境、地区、采收季节、采收月份、测量日、运行顺序、采样时间、贮藏时长）的关联性，效应量以Cramér's V和调整兰德指数（ARI）量化，所有p值经Holm–Bonferroni校正（pHolm < 0.05）。
**研究背景与问题**
蜂蜜是由意大利蜜蜂（Apis mellifera L.）生产的天然甜味剂，按蜜源分为花蜜蜜和蜜露蜜，其化学组成、营养特性与感官属性受植物来源及环境气候因素（太阳辐射、降雨、湿度、海拔）强烈驱动。蜂蜜约含200种成分，主要由糖类和水组成，另含微量有机酸、酶类、酚类及多种挥发性有机化合物（VOCs）。不同植物种贡献物种特异性VOCs，形成特征性香气轮廓，决定蜂蜜品质、感官性状与消费者偏好。挥发性馏分虽仅占总组成的很小比例，但包含烃类、醛类、醇类、酮类、酯类和萜烯类，为植物源和地理源认证提供稳健的化学指纹。消费者通常偏好成分明确、感官特征鲜明的单花蜂蜜，而多花蜂蜜往往价格较低且受欢迎程度较低。全球蜂蜜产量持续增长，预计2024年将达200万吨。塞浦路斯位于地中海盆地，拥有超过1600个植物分类群的高花卉生物多样性和多样化生态生境，生产具有复杂香气轮廓的优质蜂蜜，每年采收两次：春季蜂蜜通常以柑橘为基础，夏季蜂蜜源自百里香、桉树及其他芳香植物。然而，由于高植物异质性和采样地点间植物群落重叠，建立塞浦路斯多花蜂蜜的精确化学定义仍具挑战性。尽管存在这一自然丰富性，调查塞浦路斯多花蜂蜜挥发性轮廓的研究仍然稀少，且主要局限于传统分析方法。传统上，VOCs采用顶空固相微萃取耦合气相色谱-质谱联用（HS-SPME/GC–MS）分析，该方法已应用于塞浦路斯多花蜂蜜，虽提供高化合物分离度和可靠鉴定，但需预浓缩步骤、色谱分离和质谱检测，分析时间较长，结果可能受萃取条件影响，样品制备过程中可能发生化合物损失或转化。相比之下，PTR-Qi-TOF-MS能够直接从顶空样品中快速、实时分析VOCs，无需任何样品制备，具有高灵敏度（ppb级）和最少样品处理，允许连续监测和高通量分析，并利用软电离最小化分子碎裂，增强挥发性轮廓的整体信息含量。尽管PTR-Qi-TOF-MS因缺乏色谱分离而无法最终鉴定结构异构体，但作为补充技术，特别适用于比较 profiling、模式识别和大样本集分析。PTR-Qi-TOF-MS还是一种本质绿色的分析技术，无需溶剂或不可再生载气，仅需蒸馏水作为消耗品。本研究旨在评估PTR-Qi-TOF-MS作为基于非靶向挥发性指纹图谱表征塞浦路斯多花蜂蜜的快速分析工具的有效性，为源自异质性地中海生境的蜂蜜化学复杂性提供新见解。
**主要关键技术方法**
研究人员于2023年5月至10月从北塞浦路斯六个地区61个不同地点采集74份蜂蜜样品（法马古斯塔20份、凯里尼亚17份、尼科西亚13份、莫尔富9份、特里科莫9份、莱夫卡6份），4±2°C贮藏至分析。采用直接顶空PTR-Qi-TOF-MS（Ionicon Analytik GmbH，奥地利因斯布鲁克）分析：样品25±1°C平衡30 min后，20 g置于100 mL玻璃瓶密封，顶空积累10 min；通过80°C加热PEEK入口管以100 sccm流速连续采样180 s，仅使用3–48 s采集窗口进行信号平均；漂移管条件为3.8 mbar压力、80°C温度、1000 V漂移电压，E/N为141 Td；以H3O+为质子供体，适用于质子亲和力高于水（691.7 kJ/mol）的VOCs；采用m/z 21.022、203.943和330.848三个参考离子连续质量校准；每样品三次技术重复。数据经R包ptairMS预处理，包括质量轴校准、峰检测、基线去除和噪声阈值处理，手动排除污染物、离子源化学离子、负质量亏损离子和水簇离子；采用马氏距离自动化离群值检测（80%总方差的主成分空间，卡方分布第97.5百分位，p < 0.05）；技术重复聚合后（排除9个技术伪影重复），以样品均值矩阵（n = 74）进行PCA、K-means聚类和ANOVA；单因素ANOVA配合Benjamini–Hochberg FDR校正（q < 0.05），Tukey's HSD事后检验（p < 0.05）仅应用于FDR显著质量；基于欧氏距离和Ward凝聚法对前40个显著VOCs生成层次聚类热图；采用Fisher精确检验（蒙特卡洛模拟，2000次重复）和Kruskal–Wallis检验评估聚类与元数据关联，效应量以Cramér's V和ARI量化，p值经Holm–Bonferroni校正。
**研究结果**
*挥发性轮廓的推定鉴定*：初步分析对132个质量特征（以ppbv表示）进行，通过比较测量精确质量与文献和数据库理论值进行暂定归属（质量误差<10 ppm）。羰基化合物（醛类和酮类）为最常归属的化学类别，包括甲醛（m/z 31.0176）、戊-1-烯-3-酮（m/z 85.0649）、己烯醛（m/z 115.0743）及其潜在结构异构体；苯乙醛（m/z 121.0659）此前在利马索尔地区塞浦路斯多花蜂蜜中报道较高丰度。烃类占暂定归属的相当比例，包括1-甲基环己烯（m/z 97.1004）、1-苯基庚烷（m/z 177.1635）和薁（m/z 129.0692）。其他归属类别包括苯环化合物（如对伞花-8-醇及相关异构体，m/z 151.1122；苯并噁唑，m/z 120.0439）、含硫化合物（甲硫醇，m/z 49.0102；二甲基硫醚，m/z 63.0257）和呋喃类（2,5-呋喃二甲醛，m/z 125.0224；4,7-二甲基苯并呋喃，m/z 147.0801；1-(2-呋喃基)乙酮，m/z 111.0434）。萜类化合物包括对伞花烯（m/z 133.1001）、相关结构异构体和单萜烯（m/z 137.1314），为另一相关挥发性化合物类别。
*多变量统计分析与聚类*：离群值检测方案排除9个分析重复（各来自不同蜂蜜样品）。PCA解释总方差的48.4%，PC1和PC2分别占35.2%和13.2%。按花卉生境分组时，生境类别间观察到大量重叠，尽管存在某些分布趋势：干旱草原/旱地样品广泛分布于PCA空间， particularly沿正PC1轴；柑橘园样品主要位于右上象限；城市/观赏植物样品也倾向于占据PC1正值侧。按地理区域分组时呈现类似模式，区域间大量重叠。总体而言，PCA未揭示按花卉生境或地理区域的清晰分离。无监督K-means聚类分析确定最优划分为两个聚类：聚类1包含20份蜂蜜样品，聚类2包含54份。两聚类均包含来自多个花卉生境和地理区域的样品。聚类1包括干旱草原/旱地5份、灌木地4份、灌木地与地中海森林4份、农业/作物4份、城市/观赏植物1份、灌木地与农林/农业生境1份、柑橘园1份；地理上来自尼科西亚5份、凯里尼亚4份、法马古斯塔4份、特里科莫3份、莱夫卡3份、莫尔富1份。聚类2包括干旱草原/旱地21份、城市/观赏植物10份、柑橘园9份、灌木地4份、灌木地与地中海森林3份、灌木地与农林/农业生境3份、农业/作物3份、沼泽地1份；地理上来自尼科西亚8份、凯里尼亚13份、法马古斯塔16份、特里科莫6份、莱夫卡3份、莫尔富8份。PCA双标图叠加两聚类划分与前20个最具影响力VOC质量特征的载荷向量，所有20个向量均投影至负PC1象限，包括m/z 81.0685、85.0649（暂定归属为戊-1-烯-3-酮及相关结构异构体）、67.053、69.032、122.0682、117.0868和89.0583。对前40个最具判别性质量特征的层次聚类显示两聚类间标准化信号强度的广泛差异， particularly m/z 57.0323、85.026、113.057、43.0167、87.0429、72.0511、71.0477和53.0377在聚类1中强度高于聚类2。例如，m/z 57.0323在聚类1中平均浓度为4.10 ± 1.86 ppbv，聚类2中为1.01 ± 0.36 ppbv；m/z 43.0167分别为123 ± 54和29.3 ± 16.8 ppbv。按统计显著性排序的前15个差异质量信号（pFDR < 0.05）中，m/z 57.0323（η2 = 0.702）、85.026（η2 = 0.654）、113.057（η2 = 0.646）、43.0167（η2 = 0.636）和87.0429（η2 = 0.620）效应量最大。ANOVA配合Benjamini–Hochberg校正确认132个保留质量特征中110个在聚类间差异显著（FDR < 0.05）。由于聚类和后续统计检验均基于同一VOC数据集，这些比较为描述性，表征与聚类划分相关的特征而非提供聚类分离的独立验证。
*聚类与元数据的关联*：聚类归属与花卉生境经多重检验校正后无统计学显著关联（Fisher精确检验，p = 0.0551；Holm校正p = 0.3307；Cramér's V = 0.420）。地理区域（p = 0.5058；Cramér's V = 0.244）、采收季节（p = 1.0000；Cramér's V = 0.017）和采收月份（p = 0.9758；Cramér's V = 0.084）亦无显著关联。单变量分析识别19个质量特征在花卉生境间经FDR校正后差异显著，最强生境相关效应为m/z 123.0456（F = 6.35，η2 = 0.366，FDR校正p = 0.0034），其次为m/z 123.1154、41.0019、151.1122和49.0102。相反，聚类归属与PTR-MS测量日间观察到强关联（p < 0.0001；Cramér's V = 0.933；Holm校正p = 0.0001）：大多数聚类1样品于2025年1月9日分析，而聚类2样品主要分布于其他测量日。聚类归属与运行顺序在多重检验校正前呈较弱关联（Kruskal–Wallis p = 0.013），但Holm校正后不显著（校正p = 0.0912）。采样时间（p = 0.7563）和贮藏时长（p = 0.8961）无显著关联。元数据分析揭示样本特征间存在实质性相互依赖：花卉生境与采收季节强关联（Cramér's V = 0.67），与地理区域强关联（V = 0.66），区域亦与采收季节强关联（V = 0.71）。
**讨论与结论**
研究人员从方法学角度指出，本研究的预处理和质量控制程序旨在最小化分析干扰影响，包括硅氧烷、电离相关伪影、负质量亏损信号以及低强度或潜在不可靠特征；多变量统计分析使用每份蜂蜜样品的均值而非将重复测量视为独立观测，这一策略得到重复间高重复性的支持（中位组内相关系数ICC > 0.80），基于重复水平数据的线性混合效应模型敏感性分析和几何投影检验（97.7%一致性）为样品水平分析策略的稳健性提供了额外支持。PCA揭示蜂蜜样品间存在实质性变异，K-means聚类识别出两个具有对比VOC轮廓的组，热图进一步突出多个质量特征信号强度的广泛差异，表明聚类分离反映整体挥发性指纹的变异而非单一孤立信号的差异。聚类1约占数据集的27%，通常以较高VOC信号强度为特征，包括m/z 43.0167、57.0323和69.032等突出特征；聚类2包含大多数样品，平均信号强度相对较低。这些模式证明PTR-Qi-TOF-MS结合多变量统计分析能够识别多花蜂蜜间挥发性相关信号相对丰度的差异，但聚类1中观察到的较高信号强度不应自动解释为挥发性多样性更大或化学组成更丰富的证据，因为单个质量特征可能包含多个离子或化合物的贡献。与聚类分离相关的质量特征暂定关联至不同化学类别，表明观察到的差异涉及挥发性馏分的多个组分，但这些归属主要基于精确质量，应视为暂定；没有色谱分离和参考标准或互补分析方法确认，单个化合物不能始终可靠区分， particularly当异构体或重叠离子贡献可能存在时。聚类归属与样本元数据的关系进一步强调在生态或地理术语中解释这些挥发性指纹的复杂性：尽管统计分析识别19个与花卉生境显著关联的质量特征，但样品在聚类间的整体分布不支持与植物或地理来源的明确关系；花卉生境、地理区域和采收季节之间的实质性关联（Cramér's V值范围0.66–0.71）表明这些变量在数据集中并非独立，这种共变限制了分离任何单一因素对观察到的VOC模式贡献的能力，差异可能反而反映花卉组成、当地环境条件和季节变异的组合。此外，聚类归属与测量日的关联， particularly聚类1样品集中于单一分析日，提出日特异性仪器或环境条件促成观察到的分离的可能性；鉴于聚类1中通常观察到的较高信号强度，这一关联尤其相关，尽管可用结果未建立测量日与聚类归属之间的因果关系，但表明分析批次效应不能排除。因此，两个聚类应解释为以不同测量VOC指纹为特征的组，而非内在不同的植物、地理或生态蜂蜜类型的证据。未来研究应在分析批次间分布来自不同生境、区域和采收期的样品，并纳入适当的质量控制样品和重复测量，以更好区分生物学变异与分析效应。结论部分指出，本研究证明直接顶空PTR-Qi-TOF-MS结合优化的化学计量学工作流程代表一种快速、可重复且有效的非靶向筛选方法，用于表征塞浦路斯多花蜂蜜的VOC轮廓；严格质量过滤标准和重复质量控制的应用有助于最小化分析伪影，确保后续分析基于可靠化学信号；多变量分析包括PCA、K-means聚类和层次热图分析揭示两个以多个VOC质量信号广泛且可重复的定量差异为特征的 distinct聚类；然而，多花蜂蜜复杂且重叠的挥发性轮廓，连同观察到的聚类归属与测量日之间的关联，表明这些模式应谨慎解释，不能直接归因于植物或地理来源；尽管分析变异性可能促成观察到的聚类，单个质量信号中识别的显著差异（pFDR < 0.05）表明花卉生境可能影响蜂蜜挥发组学的特定组分；总体而言，研究结果支持使用直接顶空PTR-Qi-TOF-MS作为比较多花蜂蜜挥发性指纹的快速筛选工具，同时强调在该方法用于推断来源或认证蜂蜜之前需要仔细控制分析变异性和独立验证；未来研究应采用整合方法，将PTR-Qi-TOF-MS与互补技术（如GC-MS/MS用于化合物鉴定和结构解析、蜂花粉学分析、靶向代谢组学和感官评价）相结合，这种多方法策略将有助于阐明植物和环境因素对蜂蜜挥发性轮廓的贡献，并增强多花蜂蜜可追溯性、质量评估和认证方法的可靠性。
