《The FEBS Journal》：A novel rare splice variant of the human voltage-dependent proton channel hHV1
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人类电压门控质子通道（hHV1）的多样性完全源于选择性剪接或翻译后修饰。除经典的273个氨基酸形式（hHV1-l）外，已有两种较短亚型（HVCN1S和HV1Sper）被报道，其特征均为N端结构域截短。迄今为止，人类中尚未鉴定出长于hHV1-l的亚型。在此，研究
人类电压门控质子通道（hHV1）的多样性完全源于选择性剪接或翻译后修饰。除经典的273个氨基酸形式（hHV1-l）外，已有两种较短亚型（HVCN1S和HV1Sper）被报道，其特征均为N端结构域截短。迄今为止，人类中尚未鉴定出长于hHV1-l的亚型。在此，研究人员报道了一种新型“极长”hHV1剪接变体（hHV1-vl），其包含由HVCN1基因第12外显子选择性剪接产生的47个氨基酸N端插入。该额外氨基酸序列被预测为大体无结构，并包含多个潜在磷酸化位点。分子动力学（MD）模拟进一步表明，Thr29下游的保守多聚谷氨酸基序可与S4段底部的胞质精氨酸残基相互作用。巢式PCR在健康组织（脑桥和脉络丛上皮细胞）以及三种不同类型淋巴瘤中明确鉴定出hHV1-vl。然而，定量PCR显示，在分析的组织中hHV1-vl表达水平较低，仅占HVCN1总转录本的0.3–2%。hHV1-vl的异源表达及膜片钳记录表明，该亚型保留了质子通道的关键特性，包括高质子选择性和电压及pH依赖性电导。与经典的273个氨基酸hHV1-l亚型相比，hHV1-vl表现出相似的门控参数，包括质子选择性、ΔpH依赖性门控、电导密度、gH–V关系和关闭动力学，但激活动力学显著减慢。
一、研究背景与科学问题
电压门控质子通道（HV）是一类广泛分布于真核生物中的膜蛋白，在原核生物中则完全缺失。研究推测，HV通道在真核生物进化早期通过电压传感结构域从祖先NaV或CaV通道基因中分离而来。在人类中，电压门控质子通道hHV1在吞噬细胞呼吸爆发期间的电荷补偿、多种细胞类型和过程中的胞质pH调节等生理过程中发挥重要作用。此外，hHV1在多种癌症类型中过表达，其活性与肿瘤进展和恶性程度相关，因此已成为一个有吸引力的药理学靶点。
结构上，HV通道由四个跨膜片段（S1–S4）组成，与电压门控钾通道和钠通道的电压传感结构域同源，但缺乏构成经典孔结构域的S5和S6片段。因此，HV通道可被视为专门用于质子传导的独立电压传感结构域。N端和C端均位于胞质侧，C端主要通过卷曲螺旋结构域介导同源二聚化，这是协同门控的基础。相比之下，N端（人类中约100个氨基酸）具有多种调节功能，包括介导与胆固醇富集膜结构域的相互作用、调节门控动力学和pH依赖性，以及包含促进增强门控模式的磷酸化位点。
尽管与软体动物等无脊椎动物相比，哺乳动物中HV通道的多样性相对有限，但人类中确实存在通过转录后和翻译后机制产生的多样性。人类HVCN1基因位于染色体12q24.11，编码hHV1通道。除经典的273个氨基酸亚型（hHV1-l）外，已有两种天然变体被报道，均涉及由不同分子机制产生的N端截短：HV1Sper通过蛋白水解切割前68个氨基酸产生，在精子细胞中表达；HVCN1s（本文中为hHV1-s）则源于替代翻译起始位点，缺少前20个氨基酸，在恶性B细胞中高表达。两种变体与经典hHV1-l相比均表现出改变的门控特性。在小鼠中，已报道了额外的N端延伸亚型（269个氨基酸经典形式加上+42或+4个氨基酸的变体），并与功能多样化相关。相比之下，人类中此前尚未报道N端延伸的亚型。因此，本研究旨在探索人类是否存在N端延伸的hHV1新亚型及其功能特征。
二、研究内容与主要结论
研究人员报道了一种新型的人类电压门控质子通道hHV1延伸亚型——“极长”变体（hHV1-vl），其包含在经典hHV1-l序列N端第7位赖氨酸（Lys7）和第8位丙氨酸（Ala8）之间插入的47个氨基酸。该延伸由HVCN1基因的替代第12外显子编码。巢式PCR和定量PCR在脉络丛上皮细胞和三种淋巴瘤类型中鉴定出hHV1-vl的表达，其中脉络丛中相对表达量最高。分子动力学（MD）模拟显示，47个氨基酸的插入大体保持无结构状态，未形成稳定的二级结构。尽管如此，该通道保留了经典通道的关键结构相互作用，包括Thr29下游的多聚谷氨酸（Poly-E）基序与S4段胞内端的Arg223、Arg226和Arg230之间的相互作用。通过膜片钳实验的功能表征表明，hHV1-vl保留了HV1通道的标志性生物物理特性，并作为质子外排通道发挥作用，与经典亚型相似。其ΔpH依赖性门控未发生显著改变，与长型（hHV1-l）和短型（hHV1-s）亚型相当。然而，与hHV1-l相比，hHV1-vl表现出显著更慢的激活动力学，表明N端延伸选择性影响通道开放而不显著改变pH感知。这些发现提示N端延伸可能代表一种在表达该亚型的人类组织中微调HV1通道动力学的新机制。
三、主要技术方法
研究人员使用了以下关键技术方法：数据库分析（BLAST搜索鉴定GNOMON算法预测的hHV1转录本变体并绘制基因结构）；巢式PCR（两步PCR程序扩增新型外显子12，引物位于外显子11和13上以跨越内含子避免基因组污染，并通过BamHI限制性酶切和直接DNA测序验证）；定量PCR（使用五种不同的TaqMan检测方法分析hHV1-vl在不同组织中的相对表达水平，以GAPDH为内源对照）；异源表达（在HEK 293T细胞中瞬时转染hHV1-vl-GFP融合构建体）；全细胞膜片钳记录（EPC 10放大器记录质子电流，分析激活和去激活动力学、质子选择性、ΔpH依赖性门控和有效门控电荷）；结构建模（ColabFold v1.6.1（AlphaFold2）生成hHV1-vl结构模型）；分子动力学（MD）模拟（AMBER22使用ff19SB蛋白力场和lipid21脂质力场，在POPC脂质双分子层中进行1μs轨迹模拟）。样本来源包括不同脑区、甲状腺、脉络丛上皮细胞以及三种不同形式的淋巴瘤（标准、霍奇金、非霍奇金）的cDNA样本（Bio Chain公司）。
四、研究结果
（一）HVCN1基因结构
对GenBank中编码人类电压门控质子通道（hHV1）条目的分析鉴定出18种不同的转录本变体，其中一些经实验证实，另一些仅由GNOMON算法预测。将所有转录本变体映射到相应的人类基因组DNA上，鉴定出由17个外显子组成的基因结构。外显子1–10构成5′-UTR；外显子16和17包含完整的3′-UTR和polyadenylation位点。外显子11–16编码hHV1，两个不同的起始密码子位于外显子11（hHV1-l）和13（hHV1-s）上。18个hHV1 cDNA仅编码三种不同的hHV1蛋白：九个转录本变体编码hHV1-l，一个编码hHV1-s，八个编码新型hHV1-vl。
（二）新型“极长”hHV1剪接变体（hHV1-vl）
hHV1-vl在经典hHV1-l第7个氨基酸后包含47个氨基酸插入，全部由替代外显子12编码。该47个氨基酸片段内发现五个推定的磷酸化位点（3个丝氨酸、2个苏氨酸残基）以及一个酰胺化共有基序（GRK）。AlphaFold模型未预测N端区域包含额外47个氨基酸的明确二级结构。MD模拟中，N端的多聚谷氨酸（poly-E）基序与S4底部的三个精氨酸（hHV1-l中的R223、R226和R230；hHV1-vl中的R270、R273和R277）形成多个稳定的盐桥相互作用。极长亚型的苏氨酸T76（hHV1-l中的T29）不形成稳定相互作用，保持可磷酸化状态。
（三）从分离的人类组织和淋巴瘤样本中扩增hHV1-vl
通过两步巢式PCR程序，在脑桥、脉络丛上皮细胞以及所有三种测试的淋巴瘤类型中检测到hHV1-vl特异性PCR产物，并通过BamHI酶切和直接DNA测序验证。在甲状腺和所有其他分析脑区中未发现hHV1-vl特异性信号。根据PCR结果，hHV1-vl的表达水平非常低。
（四）hHV1-vl定量表达分析
定量实时PCR分析显示，在所有分析组织中hHV1均被稳健表达。淋巴瘤样本和脉络丛上皮细胞中表达较强，而不同脑样本和甲状腺中表达中等。两种针对外显子12的TaqMan检测显示，hHV1-vl表达非常低（但显著）或无表达。在三种淋巴瘤样本中均检测到明确的hHV1-vl表达。在脑桥和脉络丛上皮细胞中，仅一种TaqMan检测显示接近检测限的信号。hHV1-vl是稀有亚型，在淋巴瘤中约占所有hHV1转录本的0.3–1.2%，在脉络丛中高达2%，在脑桥中约0.3%。
（五）hHV1-vl在细胞膜中表达并作为电压门控质子通道发挥作用
在HEK 293T细胞中瞬时转染后，通过荧光观察到hHV1-vl在细胞膜中的有效表达。对23个转染细胞进行电压钳实验，记录到hHV1-vl介导的电流。观察到的电流显示HV1介导质子电流的典型特征，包括缓慢的、时间和电压依赖性的S形激活，受跨膜质子梯度（ΔpH = pHo ? pHi）调节。在测试的ΔpH范围内，gH–V曲线达到相似的饱和水平，最大电导密度为0.9 ± 0.2 nS/pF。反转电位（Vrev）数据沿质子能斯特电位（EH）的等值线分布，与高质子选择性一致，线性拟合斜率为0.97 ± 0.02（R2 = 0.973）。
（六）hHV1-vl的ΔpH依赖性
hHV1-vl的电导-电压关系在更负的ΔpH值下向更去极化电位移动，在更正ΔpH值下向更超极化电位移动，表明ΔpH依赖性门控。通过两种方法量化：Vthres–Vrev线性回归关系为Vthres = 0.81Vrev + 6.2 mV（R2 = 0.901）；V(gH,max/10)与ΔpH的关系为V(gH,max/10) = ?50·ΔpH + 11 mV（R2 = 0.994），斜率为50 mV/pH单位，高于经典的约40 mV/pH单位。
（七）hHV1-vl门控参数
在对称pH条件（pHo = pHi = 6.5）下比较hHV1-vl和hHV1-l的门控参数。两种通道在gH–V曲线定位上无显著差异，半开放概率分别为25 ± 1 mV（hHV1-vl）和23 ± 3 mV（hHV1-l）。电导密度相似：1.1 ± 0.2 nS/pF（hHV1-vl）对1.4 ± 0.3 nS/pF（hHV1-l）。去激活动力学差异极小（0.57 ± 0.04 s对0.6 ± 0.1 s）。然而，激活动力学存在显著差异：hHV1-vl激活更慢（3.8 ± 0.5 s），而hHV1-l为2.0 ± 0.3 s，差异约两倍。有效门控电荷通过极限斜率法估计为5.3 ± 0.4 e0。
五、讨论与结论
hHV1-vl在结构上保留了HV通道的所有特征性特征，包括四个跨膜结构域（S1–S4）、胞质N端和C端、S1中部的负电荷天冬氨酸残基（hHV1-vl中的D159）作为选择性过滤器、C端卷曲螺旋结构域以及三个电压传感精氨酸。质子选择性方面，Vrev?EH关系的斜率（56 mV/pH）将hHV1-vl置于经典hHV1-l（54 mV/pH）和短hHV1-s变体（57 mV/pH）之间，表明N端长度变化不显著影响HV1通道的质子选择性。pH依赖性门控方面，Vthres–Vrev关系斜率（0.81）与经典hHV1-l报道值（0.82和0.78）接近，高于短hHV1-s变体（0.74）。hHV1-vl主要作为质子外排通道发挥作用，与哺乳动物HV通道的既定作用一致。
关于激活动力学差异，MD模拟显示两种亚型中N端Poly-E基序均与S4胞质端三个精氨酸残基形成稳定相互作用，因此不能解释hHV1-vl较慢的激活动力学。47个氨基酸插入既未形成稳定二级结构，也未与通道其他区域建立持久相互作用。这与小鼠mHV1.2变体的机制形成对比，后者42个氨基酸延伸产生的额外N端α螺旋被认为有助于较慢的激活动力学。hHV1-vl的插入序列表现为高度柔性延伸，不表现出可比的结构组织。研究提示，hHV1-vl中N端延伸可能通过改变调节位点的可及性或局部环境来影响通道调控，插入片段还引入五个额外的潜在磷酸化位点（包括三个丝氨酸残基），可能代表额外的调节位点。N端延伸还可能通过与额外分子伙伴的相互作用影响通道行为。
进化分析显示，替代外显子12仅在灵长类基因组中被发现，且由于许多灵长类物种中存在移码突变，只有最接近人类的灵长类（黑猩猩、倭黑猩猩和大猩猩）会编码类似的hHV1-vl亚型。小鼠极长变体（mHV1.2）与人类hHV1-vl的序列保守性有限（47个氨基酸中8个相同），但存在一个保守的9个氨基酸基序（DxxAxLRxR）。
在生理相关性方面，hHV1-vl在脉络丛中的显著富集与该分泌上皮的特化生理学相关。脉络丛上皮细胞的主要任务是分泌脑脊液（CSF）并维持其独特的离子组成和稳定性，该过程依赖于Na+、Cl?、HCO3?和水跨过单层极化、紧密连接偶联细胞的定向运动。碳酸酐酶催化的CO2水化反应产生持续的胞内酸负荷，必须被输出以维持碳酸氢盐供应和胞质pH。hHV1-vl较慢的激活动力学与在持续分泌上皮中维持张力的、持续的胞内pH调节作用一致，而非吞噬细胞呼吸爆发所需的快速电荷补偿。其低转录丰度（≤2%的总HVCN1）提示其发挥特化或微调功能，而非对大量跨上皮质子转运的主要贡献。
综上所述，研究结论为：hHV1-vl是一种新鉴定的人类电压门控质子通道极长剪接变体，包含47个氨基酸的N端插入，由HVCN1基因替代外显子12编码。该亚型在脉络丛上皮细胞和三种淋巴瘤类型中低水平表达。功能上，hHV1-vl保留HV1通道的关键生物物理特性，包括高质子选择性和ΔpH依赖性门控，但激活动力学显著慢于经典hHV1-l亚型。N端延伸主要影响通道开放动力学而非电压感知，可能代表一种在特定人类组织中微调HV1通道动力学的新机制。
