《Neuroscience Research》：Single-Nucleus RNA Sequencing Analysis of the MECP2-Deficient Marmoset Hippocampus Reveals Altered Maturation-Associated Transcriptional Programs in Hippocampal Granule Neurons
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Rett综合征（RTT，OMIM #312750）是一种严重的神经发育障碍，主要影响女性婴幼儿，发病率约为每10,000至15,000例活产中1例。该疾病最常由甲基-CpG结合蛋白2（MECP2）基因突变引起，该基因位于X染色体上，编码一种多功能的染色质相关转
Rett综合征（RTT，OMIM #312750）是一种严重的神经发育障碍，主要影响女性婴幼儿，发病率约为每10,000至15,000例活产中1例。该疾病最常由甲基-CpG结合蛋白2（MECP2）基因突变引起，该基因位于X染色体上，编码一种多功能的染色质相关转录调控因子。RTT患者通常经历一段看似正常的早期发育阶段，随后出现发育退化，导致智力障碍、已获得的运动和语言能力丧失、自闭症特征、癫痫发作和认知损害。尽管MECP2突变被确认为Rett综合征的主要遗传病因已超过二十年，但目前对疾病机制的大部分认识源于啮齿动物模型。这些研究为MECP2缺陷相关的神经元功能障碍、突触异常和大脑发育受损提供了重要见解。然而，关于MECP2缺失如何影响灵长类大脑中的细胞和分子程序，所知相对有限。此外，对海马（一个与学习和记忆密切相关的脑区）进行的细胞类型特异性转录组学研究仍然有限。鉴于啮齿动物与灵长类动物之间的发育和解剖学差异，在非人灵长类模型中对海马细胞群进行全面表征，可能为理解MECP2缺陷导致Rett综合征病理的机制提供重要见解。
MECP2在整个中枢神经系统中高表达，在调控基因表达、染色质组织、神经元活性依赖性转录和突触可塑性方面发挥关键作用。与调控细胞命运特化的经典发育调控因子不同，MECP2被认为主要在出生后大脑发育和神经元成熟过程中发挥作用。使用Mecp2缺陷小鼠模型的研究已证明树突分支、脊柱形态、神经元兴奋性和突触传递方面的异常。此外，在出生后动物中恢复Mecp2表达可以部分挽救神经表型，提示RTT发病机制与神经元成熟和回路功能受损密切相关，而非神经元群体初始生成缺陷。这些观察结果引出了以下假说：RTT可能代表一种神经元成熟障碍，即神经元未能获得或维持完全成熟的功能状态。
越来越多的证据表明，突触功能障碍是RTT的核心病理特征。MECP2缺陷与兴奋性和抑制性神经传递改变、突触可塑性受损以及活性依赖性信号通路中断相关。多项研究报告了谷氨酸能和GABA能信号传导异常，导致神经元网络活动失衡。在分子水平上，Mecp2缺陷大脑中大量突触基因失调，提示MECP2是建立和维持成熟神经元连接所必需的。尽管先前研究已确定特定神经元和胶质细胞群在RTT发病机制中的重要作用，但灵长类海马中MECP2缺陷的细胞类型特异性分子后果仍知之甚少。
在RTT涉及的脑区中，海马因其在学习、记忆、认知和经验依赖性可塑性中的关键作用而特别受关注。RTT患者和动物模型中反复观察到海马功能障碍，包括突触可塑性、记忆形成和神经元网络活动受损。海马包含多种神经元和胶质细胞群，它们相互作用以支持认知功能，使其成为研究MECP2缺陷细胞类型特异性后果的理想系统。
在海马内，齿状回（DG）因其在整个出生后生命期间维持活跃的神经发生而构成独特结构。位于颗粒下区的神经干细胞持续产生新的颗粒神经元，这些神经元经历高度调控的增殖、分化、迁移、成熟和整合到现有神经回路的过程。这一过程对海马可塑性和记忆形成至关重要。新生成的颗粒神经元在从增殖性祖细胞转变为能够参与海马回路的成熟兴奋性神经元时，经历广泛的转录和功能重塑。由于这一成熟过程需要发育和突触程序的精确协调，因此可能对MECP2缺陷的干扰特别敏感。
先前使用Mecp2缺陷小鼠的研究提供了齿状回内异常的证据。已有报道包括神经发生改变、树突发育受损、突触可塑性降低和神经元成熟缺陷。重要的是，多项研究表明MECP2缺陷并非简单地减少神经元数量，而是影响成熟神经元特性的获得。这些观察支持以下可能性：RTT相关的认知缺陷可能源于神经元成熟不完全以及新生成神经元向海马回路整合的缺陷。
尽管通过啮齿动物研究取得了实质性进展，但关于这些发现与灵长类大脑发育的相关性仍存在重要问题。与啮齿动物相比，灵长类动物表现出更长的发育轨迹、更大的神经元复杂性和不同的海马组织模式。因此，调控神经元成熟和回路形成的转录程序可能在物种间存在显著差异。普通狨猴（Callithrix jacchus）因其复杂的社会行为、灵长类特异性大脑特征和适合遗传操作而成为研究神经发育障碍的有吸引力的模型。基因组编辑的最新进展使得能够生成MECP2缺陷狨猴，这些狨猴重现了RTT的若干行为和神经特征。因此，非人灵长类模型为在与人类大脑更接近的系统中研究RTT相关病理提供了宝贵机会。
单核RNA测序（snRNA-seq）能够在复杂脑组织内全面表征细胞异质性和转录状态。通过将细胞类型特异性转录组分析与基于网络的分析相结合，现在可以以前所未有的分辨率识别易受损细胞群、受干扰的生物通路和疾病相关分子网络。在本研究中，研究人员对从MECP2缺陷狨猴和野生型对照获得的海马组织进行了单核RNA测序。通过整合差异表达分析、基因本体富集和高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA），研究人员研究了MECP2缺陷对主要海马细胞群的影响。研究人员识别出海马中广泛的转录改变，并证明齿状回颗粒神经元表现出特别突出的异常，其特征为成熟相关转录程序受损、突触信号网络中断以及未成熟神经元特征持续存在。这些发现为RTT病理的细胞机制提供了新见解，并强调神经元成熟缺陷可能是MECP2缺陷灵长类海马功能障碍的潜在驱动因素。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
Rett综合征（RTT，OMIM #312750）是一种严重的神经发育障碍，主要影响女性婴幼儿，发病率约为每10,000至15,000例活产中1例。该疾病最常由X连锁的甲基-CpG结合蛋白2（MECP2）基因突变引起，该基因编码一种多功能的染色质相关转录调控因子。RTT患者通常经历一段看似正常的早期发育阶段，随后出现发育退化，导致智力障碍、已获得的运动和语言能力丧失、自闭症特征、癫痫发作和认知损害。
尽管MECP2突变被确认为Rett综合征的主要遗传病因已超过二十年，但目前对疾病机制的大部分认识源于啮齿动物模型。这些研究提供了关于MECP2缺陷相关的神经元功能障碍、突触异常和大脑发育受损的重要见解。然而，关于MECP2缺失如何影响灵长类大脑中的细胞和分子程序，所知相对有限。与啮齿动物相比，灵长类动物表现出更长的发育轨迹、更大的神经元复杂性和不同的海马组织模式，因此调控神经元成熟和回路形成的转录程序可能在物种间存在显著差异。
海马是RTT中特别受关注的脑区，因其在学习、记忆、认知和经验依赖性可塑性中的关键作用。海马内齿状回（DG）在整个出生后生命期间维持活跃的神经发生，新生成的颗粒神经元经历高度调控的增殖、分化、迁移、成熟和整合过程。由于这一成熟过程需要发育和突触程序的精确协调，因此可能对MECP2缺陷的干扰特别敏感。基于以上背景，本研究利用普通狨猴（Callithrix jacchus）这一非人灵长类模型，通过单核RNA测序（snRNA-seq）系统表征MECP2缺陷对海马各细胞群的影响，以期弥合啮齿动物模型与人类疾病之间的转化鸿沟。
二、研究设计与主要结论
研究人员对4只4月龄雄性普通狨猴（2只野生型MECP2+/y和2只MECP2缺陷MECP2-/y）的海马组织进行了单核RNA测序。MECP2缺陷狨猴通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑生成。经质量控制后获得34,150个细胞核用于后续分析。通过整合差异表达分析、基因本体（GO）富集和高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA），研究人员系统研究了MECP2缺陷对海马各细胞群的影响。
研究得出以下主要结论：MECP2缺陷在齿状回神经发生谱系的早期阶段（神经干细胞和神经祖细胞）影响有限，但显著破坏颗粒神经元的成熟相关转录程序和突触信号网络；齿状回颗粒神经元是海马中最易受MECP2缺陷影响的细胞群；MECP2缺陷还在CA神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞/巨噬细胞、室管膜细胞和成熟少突胶质细胞中引起广泛的细胞类型特异性转录改变；跨物种比较揭示了狨猴与小鼠模型之间既有共享的转录改变，也存在显著的物种依赖性差异。
三、关键技术与方法
本研究采用的主要技术方法包括：单核RNA测序（snRNA-seq）技术，使用10x Genomics Chromium平台和Cell Ranger流程进行文库制备与数据处理，比对到狨猴参考基因组（calJac4）；Seurat流程进行数据整合、降维、聚类和细胞类型注释；免疫荧光染色验证MECP2蛋白表达缺失；差异表达分析使用Wilcoxon秩和检验，并进行基于动物水平的伪bulk分析（edgeR）验证；基因签名评分使用AddModuleScore功能；基因本体富集分析使用Metascape平台；高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）用于构建基因共表达模块并识别枢纽基因。
四、研究结果
结果一：单核RNA测序成功捕获狨猴海马细胞类型。 通过无监督聚类和UMAP降维，研究人员在狨猴海马中鉴定出23个转录上不同的细胞群，包括颗粒神经元、神经母细胞、CA神经元、中间神经元、星形胶质细胞、放射状胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质前体细胞（OPCs）、血管内皮细胞、软脑膜细胞、室管膜细胞和小胶质细胞/巨噬细胞。总体细胞结构在野生型和MECP2缺陷动物之间基本保守，提示MECP2缺陷改变细胞状态而不显著破坏整体海马细胞类型格局。
结果二：MECP2缺陷对齿状回神经发生早期阶段影响有限。 研究人员对齿状回相关细胞群进行重聚类分析，鉴定出神经干细胞、神经祖细胞、未成熟颗粒神经元和成熟颗粒神经元四个细胞群。神经干细胞标志物（TNC、NES、SOX2）的表达水平在两种基因型之间相当，增殖标志物MKI67在神经祖细胞中的表达在两种基因型之间也无显著差异，表明MECP2缺陷对齿状回神经发生的早期阶段转录状态影响有限。
结果三：差异表达分析揭示MECP2缺陷颗粒神经元中成熟相关和突触转录程序受损。 在齿状回谱系各细胞群中，未成熟和成熟颗粒神经元含有最大数量的差异表达基因（DEGs）。成熟颗粒神经元签名评分在MECP2缺陷成熟颗粒神经元中显著降低，神经元活性评分在未成熟和成熟颗粒神经元中均显著降低。GO富集分析显示，未成熟颗粒神经元中下调基因富集于神经元系统、突触组织、细胞连接组织等通路，上调基因富集于细胞突起组织和突触囊泡介导转运等过程；成熟颗粒神经元中下调基因富集于突触组织调控、G蛋白偶联受体信号通路调控、神经系统发育正调控等通路，上调基因富集于VEGFA-VEGFR2通路、NO-cGMP-PKG介导的神经保护、雌激素信号等通路。
结果四：共表达网络分析揭示颗粒神经元中成熟和突触模块改变。 hdWGCNA分析在颗粒神经元中鉴定出四个共表达模块（GranN1-GranN4）。GranN1主要富集于成熟颗粒神经元，富集突触信号和神经元通讯通路；GranN2富集于未成熟颗粒神经元，富集神经元发育、轴突导向和神经元突起组织通路。枢纽基因与DEGs的重叠分析鉴定出NRG3、NRXN3、TMEFF2、GABBR2和GRM7等候选调控因子，这些基因在MECP2缺陷颗粒神经元中下调。动物水平伪bulk分析证实其中部分基因（如NRG3、NRXN3）在两个MECP2缺陷动物中均表现出一致性下调。
结果五：MECP2缺陷在海马神经元和胶质细胞群中诱导广泛的转录改变。 CA神经元中上调和下调基因均富集于神经元信号、突触组织和神经递质转运等通路；星形胶质细胞中上调基因富集于胆固醇生物合成和代谢过程，下调基因富集于神经元发育和突触组织通路；小胶质细胞/巨噬细胞中上调基因富集于蛋白泛素化、抗原加工等通路，下调基因富集于受体酪氨酸激酶信号和突触相关通路；室管膜细胞中上调基因富集于离子转运，下调基因富集于纤毛运动和微管运动；成熟少突胶质细胞中上调基因富集于MAPK信号和神经元形态发生，下调基因富集于细胞连接组织和突触组织。
结果六：跨物种比较揭示狨猴和小鼠齿状回DEGs的共享与差异。 与半合子Mecp2-/y小鼠齿状回数据集比较，在狨猴颗粒神经元和小鼠齿状回之间鉴定出共享的下调基因，包括GRIA4、DPP10、GRIP1和TRPC5。与杂合Mecp2+/-小鼠比较，LRFN5为三个数据集共享的下调基因。这些结果揭示了狨猴和小鼠RTT模型之间选定的共享转录异常，同时也显示了DEG谱中显著的物种和模型依赖性差异。
五、讨论与结论
本研究通过单核RNA测序对MECP2缺陷狨猴海马进行了细胞类型分辨的表征。研究发现MECP2缺陷优先影响颗粒神经元分化和成熟的后期阶段，而非齿状回神经发生的早期阶段，这与先前Mecp2缺陷小鼠模型中的观察一致，并将这些发现扩展至非人灵长类模型。颗粒神经元中成熟相关转录程序受损、突触信号网络失调和未成熟神经元特征持续存在，支持神经元成熟缺陷是RTT跨物种保守的病理机制这一假说。
在枢纽基因中，GABBR2特别值得关注。该基因编码GABAB受体亚基2，是抑制性神经传递的关键组分，调控神经元兴奋性、突触可塑性和网络同步化。值得注意的是，在无MECP2突变的Rett样表型患者中已鉴定出GABBR2致病性变异，提示MECP2缺陷和GABBR2功能障碍可能汇聚于涉及神经元成熟和回路功能的共享下游通路。
此外，星形胶质细胞中胆固醇生物合成通路上调可能反映对神经元成熟受损的代偿反应，因为星形胶质细胞来源的胆固醇在突触发育中发挥关键作用。CA神经元中的突触组织通路失调提示突触功能障碍超出齿状回范围。
综上所述，本研究结论为：MECP2缺陷在狨猴海马中诱导广泛的细胞类型特异性转录改变，其中齿状回颗粒神经元表现出最突出和连贯的异常，其特征为成熟相关转录程序受损、神经元活性特征降低和突触信号网络广泛失调。NRG3、NRXN3、GABBR2和GRM7等枢纽基因的鉴定为理解MECP2缺陷导致海马功能障碍的分子机制提供了候选靶点。这些发现为RTT病理的细胞机制提供了新见解，并强调神经元成熟缺陷是MECP2缺陷灵长类海马功能障碍的潜在驱动因素，具有重要的转化医学意义。
