《Pathology》：Gene expression profiling improves on histological grading in predicting follicular lymphoma behaviour
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滤泡性淋巴瘤（FL）是一种生物学异质性惰性B细胞恶性肿瘤，传统上依据免疫组化分级进行分类。然而，分级无法可靠反映潜在的分子或临床多样性，且存在观察者间差异。因此，现代分类已弃用FL分级，凸显了对精确、基于生物学方法的需求。研究人员对来自两个专家淋巴瘤中心的48
滤泡性淋巴瘤（FL）是一种生物学异质性惰性B细胞恶性肿瘤，传统上依据免疫组化分级进行分类。然而，分级无法可靠反映潜在的分子或临床多样性，且存在观察者间差异。因此，现代分类已弃用FL分级，凸显了对精确、基于生物学方法的需求。研究人员对来自两个专家淋巴瘤中心的48例诊断性淋巴结FL样本进行了bulk RNA测序，样本涵盖1/2级（G1/2FL；n=13）、3A级（G3AFL；n=23）和3B级（G3BFL；n=12）。差异基因表达分析显示，G3BFL表现出细胞周期相关基因的上调，包括MKI67、细胞周期蛋白（cyclins）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs），与增殖活性增加相一致。主成分（PC）分析确定患者性别是转录组变异的主要来源，PC1按性别对样本进行分层。值得注意的是，对G3AFL样本的无监督聚类识别出两个生物学上不同的亚组：一个与G1/2FL一致，另一个与G3BFL一致。与G1/2FL聚类的G3AFL患者相比，与G3BFL聚类的G3AFL患者中24个月内早期进展更为频繁（56% vs 14%）。这些发现表明，转录组谱分析可能比单纯组织学分级更好地对FL生物学和预后进行分层。将性别确定为主要的转录组决定因素，凸显了淋巴瘤生物学中一个尚未充分探索的变量。研究结果支持重新评估当前FL分类和治疗范式，特别是对于G3AFL，并倡导基于生物学的临床试验设计。
**研究背景与问题**
滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma, FL）是最常见的惰性非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma, NHL），占全部NHL的20%–30%。世界卫生组织（WHO）传统上依据中心细胞与中心母细胞比例对FL进行分级，其中3B级FL（G3BFL）以滤泡完全由中心母细胞组成为特征，区别于3A级FL（G3AFL）。2022年国际共识分类（International Consensus Classification）修订版保留了该分级框架，但WHO第5版分类已取消FL分级，将G1–3FL统称为"经典型FL"（classic FL），并将G3BFL命名为"滤泡性大细胞淋巴瘤"（follicular large cell lymphoma）。WHO简化分级策略的部分理由在于FL组织学分级可重复性有限，专家血液病理学家之间G3FL的一致率仅为38%–61%，且分级区分的临床相关性有限。治疗上，G3BFL通常采用蒽环类为基础的免疫化疗，而G1–3AFL在部分患者中常采取观察策略，但治疗与观察之间缺乏明确指征，新兴数据正在挑战这些范式。因此，迫切需要更准确的生物学表征以实现个性化治疗目标，理解FL中明显的临床异质性。少数研究探索了分子表征以改进超越免疫组化分级的FL生物学区分，但因样本量有限和基因覆盖范围窄而结果相互矛盾。基因表达谱（gene expression profiling, GEP）通过提供客观、可重复、高维的肿瘤分子特征，可捕捉细微生物学差异，为传统组织学分级的局限性提供了潜在解决方案。为通过肿瘤内在生物学改进基线FL分层和预后判断，研究人员评估了FL各分级间的差异GEP，并将分子特征与分级及临床结局相关联。
**关键技术方法**
研究人员从澳大利亚两个三级淋巴瘤中心连续纳入2014至2020年新诊断的淋巴结FL肿瘤样本，纳入标准为诊断时具有足量福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed, paraffin-embedded, FFPE）组织。所有样本按WHO第4版标准分类，并经专家淋巴瘤血液病理学家盲法复核，分级不一致的样本被排除。主要技术方法包括：从FFPE组织提取总RNA并构建RNA测序文库，在NextSeq 500或NovaSeq 6000平台（Illumina）测序生成50或75碱基对双端读长；使用HISAT2 v2.2.1比对至人类参考基因组（hg19），HTSeq进行基因水平定量；在R中使用DESeq2 v1.40.2分析原始计数矩阵，差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）定义为校正p值<0.05且绝对log2倍数变化≥1；采用方差稳定化转换（variance stabilising transformation, VST）并进行批次效应校正后行主成分分析（principal component analysis, PCA）；使用clusterProfiler进行通路富集分析；以Kaplan–Meier法计算总生存和無进展生存，以诊断后24个月内疾病进展（progression of disease within 24 months, POD24）作为临床有意义终点。
**研究结果**
**G3BFL呈现细胞周期驱动的增殖性转录程序**：对G1/2FL与G3BFL的差异基因表达分析识别出与高级别疾病相关的独特转录特征。火山图显示G3BFL中显著上调的基因涉及DNA复制和丝分裂过程，包括MKI67、细胞分裂周期（cell division cycle, CDC）基因、细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶——细胞周期进程的关键调控因子。基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析显示G3BFL上调基因显著富集于丝分裂、细胞周期进程和DNA复制相关生物学过程，表明G3BFL以更具增殖性和细胞周期驱动的转录程序为特征。
**患者性别是转录组变异的主要来源**：对FL样本bulk RNA-seq数据的PCA确定患者性别是转录组变异的主要来源，主成分1（PC1）按性别对样本分层；相比之下，PC2和PC3上未见FL分级的明显分离。
**G3AFL内部存在转录异质性并与预后相关**：比较G3AFL与G3BFL时，G3BFL组无显著上调基因，所有达统计学阈值的基因在G3BFL中相对G3AFL均下调，但通路富集分析未识别显著富集的生物学通路，最显著下调的基因集与RNA剪接和处理相关。使用G1/2FL与G3BFL差异表达基因对样本进行无监督层次聚类， delineated出两个不同的G3AFL亚组——分别与G1/2FL和G3BFL聚类，表明G3AFL内存在转录异质性。疾病进展分析显示，与G1/2FL聚类的7例G3AFL患者中仅1例（14%）出现早期进展，而与G3BFL聚类的16例G3AFL患者中9例（56%）出现早期进展；与G1/2FL聚类者相比，与G3BFL聚类的G3AFL病例24个月内早期进展的比值比为7.1倍（95% CI 0.6–392.4, p=0.09）。
**讨论与结论**
讨论部分指出，G3BFL临床上被认为具侵袭性行为主要源于小型（n<25）回顾性队列，许多早于利妥昔单抗广泛应用时代，现行国际治疗指南推荐G3BFL按弥漫性大B细胞淋巴瘤管理。然而近期涉及较大G3AFL和G3BFL队列的分析挑战了这一范式，显示两亚型结局相当，本研究的生物学发现可能有助于解释这些矛盾的临床观察。尽管有新兴数据，WHO第5版分类仍修订命名将G1–3AFL归为"经典型FL"、G3BFL归为"滤泡性大细胞淋巴瘤"；转录组分析支持需要更稳健的技术对FL进行亚分类，尤其研究表明G3BFL与G1/2FL显示不同GEP，且G3AFL呈现异质性，二元分级框架过度简化了FL的生物学复杂性。既往按免疫组化分级的较小分子表征研究结果矛盾，Horn等报告G1/2FL与G3AFL间存在差异转录程序但G3AFL与G3BFL间无显著转录组区分，Piccaluga等则显示G3BFL形成独立于G1/2FL和G3AFL的独特分子簇，差异可能反映方法学差异包括小样本量（分别为n=6和n=4）和分析基因变异。Sun等近期按组织学分级探索FL全外显子测序，显示G1/2FL与G3AFL共享共同突变景观，而G3BFL缺乏低级别FL中常见的表观遗传调控因子如CREBBP和KMT2D的复发性突变；与本研究相似，转录组显示较高级别与细胞周期通路活性相关，提示高级别疾病增殖活性增强。本研究通过分析迄今最大规模的中心分级FL转录组队列之一，使用标准化方法和注释良好的临床数据，直接解决了其中若干局限性。关于患者性别作为转录组变异主要来源，泛癌转录组分析一致显示基因表达、免疫细胞组成和突变负荷的性别差异，健康组织包括淋巴器官中存在性别相关转录组差异并可能在恶性肿瘤背景下进一步加剧或改变，淋巴瘤相关过程的贡献不能排除。关于 upfront 治疗，全身治疗患者间治疗异质性显著，仅5例接受苯达莫司汀-利妥昔单抗，其余接受R-CHOP或其他蒽环类方案，苯达莫司汀治疗患者数量少妨碍可靠亚组比较。另一个重要结果是尽管所有病例均使用FFPE进行RNA测序，却获得出乎意料的高比对率，表明测序文库质量优异，支持利用档案FFPE标本进行未来研究的可行性。研究局限性包括回顾性数据收集和分析的固有局限、样本量适中限制亚组分析统计效能和因FL既定治疗异质性所致发现的可推广性、故意排除分级不一致样本可能引入偏倚、中位随访3.3年对惰性淋巴瘤相对较短反映进展事件有限并妨碍稳健总生存分析；未来需要前瞻性采样、单细胞谱分析、独立队列外部验证和更大队列研究来验证和扩展这些探索性发现。
结论部分译文：研究人员在迄今最大规模FL患者系列中证明，GEP delineates出一个临床和生物学侵袭性FL亚组，其特征为G3BFL和早期进展G3AFL的聚类，与G3AFL晚期/非进展者和G1/2FL中观察到的更有利结局形成对比。使用易于获取的档案FFPE，数据表明GEP可在未来FL分类系统中补充和细化组织学分级。经更大队列进一步验证，这种可及且可重复的技术可细化诊断准确性、预后判断和临床试验分层；此外，它可能识别早期耐药机制和用于药物开发的可靶向基因。FL GEP的广泛实施将生成推动真正个性化治疗策略开发所需的大数据集，最终为FL患者带来改善且更一致的结局。
