《Plant Stress》：Genome-wide characterization of NF-Y transcription factors in pepper and functional exploration of CaNF-YA7, CaNF-YB14 and CaNF-YC8 in biotic and abiotic stress responses
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核因子Y（NF-Y）是一个在植物中广泛分布的转录因子家族，在调控植物胁迫耐受性中发挥重要作用。然而，研究人员对辣椒NF-Y转录因子的了解仍然有限。本研究共鉴定到43个CaNF-Ys（Capsicum annuum NF-Ys）。进化分析表明，CaNF-Ys在辣
核因子Y（NF-Y）是一个在植物中广泛分布的转录因子家族，在调控植物胁迫耐受性中发挥重要作用。然而，研究人员对辣椒NF-Y转录因子的了解仍然有限。本研究共鉴定到43个CaNF-Ys（Capsicum annuum NF-Ys）。进化分析表明，CaNF-Ys在辣椒品种和茄科物种中高度保守，并受到强烈的纯化选择。顺式元件分析发现CaNF-Y启动子中存在大量胁迫和植物激素响应元件。表达谱分析和RT-qPCR验证表明，CaNF-Ys广泛受病原菌侵染和非生物胁迫诱导。实验结果表明，CaNF-YA7、CaNF-YB14和CaNF-YC8定位于细胞核，其中CaNF-YA7具有转录激活活性，而CaNF-YB14和CaNF-YC8具有转录抑制活性。接种试验显示，CaNF-YA7和CaNF-YB14促进病原菌定殖，而CaNF-YC8抑制病原菌定殖。在干旱和盐胁迫条件下，CaNF-YA7可能通过减小气孔开度和降低失水速率来增强辣椒的耐受性，从而缓解叶片萎蔫表型并减轻氧化损伤。总之，这些结果揭示了CaNF-Ys在植物胁迫应答中的潜在功能，阐明了三个CaNF-Y基因在辣椒抗病性和胁迫耐受性中的生物学作用，有助于鉴定候选胁迫响应基因，并为进一步解析分子机制和辣椒抗性育种提供了初步基础。
辣椒（Capsicum annuum L.）属于茄科，是全球最重要的蔬菜作物之一。然而，病害、虫害、盐害和干旱等生物与非生物胁迫严重威胁辣椒的可持续生产，而抗性品种的选育是应对田间胁迫最经济且环境友好的策略，因此鉴定抗胁迫基因是辣椒抗性育种的重要基础。核因子Y（NF-Y）转录因子在多种真核生物中广泛存在，已有研究揭示其广泛参与植物生长发育和胁迫适应，但辣椒中NF-Y家族的生物学功能信息仍然有限。为此，研究人员对辣椒NF-Ys（CaNF-Ys）进行了全基因组鉴定，并系统研究了三个候选基因CaNF-YA7、CaNF-YB14和CaNF-YC8在病害、干旱和盐胁迫中的功能。
研究人员利用保守结构域隐马尔可夫模型和BLASTp搜索，从辣椒基因组中鉴定出43个CaNF-Ys，包括14个CaNF-YAs、20个CaNF-YBs和9个CaNF-YCs。进化分析显示，CaNF-Ys在辣椒栽培种和茄科物种间高度保守，且大多数同源基因对经历强烈的纯化选择。启动子顺式元件分析表明，CaNF-Y启动子富含光响应、激素响应和胁迫响应元件。转录组表达谱和RT-qPCR分析显示，多个CaNF-Ys受病原菌侵染、干旱、盐、高温和低温等胁迫诱导。亚细胞定位实验证实CaNF-YA7、CaNF-YB14和CaNF-YC8定位于细胞核；转录活性分析表明CaNF-YA7具有转录激活活性，而CaNF-YB14和CaNF-YC8具有转录抑制活性。病原菌接种试验表明，CaNF-YA7和CaNF-YB14促进病原菌定殖，而CaNF-YC8抑制病原菌定殖；病毒诱导基因沉默（VIGS）试验进一步验证了这些基因在辣椒抗病性中的相反作用。在干旱和盐胁迫下，过表达CaNF-YA7能够显著降低叶片失水速率、减小气孔开度并减少活性氧（ROS）积累，从而增强植物耐受性；沉默CaNF-YA7则产生相反效应。而CaNF-YB14和CaNF-YC8在非生物胁迫试验中未见明显作用。这些结果揭示了CaNF-Y家族成员在辣椒逆境响应中的功能分化，为辣椒抗性育种提供了重要的基因资源和理论依据。
研究人员采用了以下主要技术方法：利用Pfam数据库的保守结构域模型和BLASTp从辣椒基因组中鉴定CaNF-Ys；通过MEGA11邻接法构建包含辣椒、拟南芥和水稻NF-Ys的系统发育树；使用TBtools进行染色体定位、基因结构和同源基因共线性分析，并计算非同义替换率（Ka）与同义替换率（Ks）的比值评估选择压力；利用PlantCARE分析启动子顺式元件；基于辣椒转录组数据库分析表达模式，并用RT-qPCR验证；通过农杆菌介导的本氏烟草（N. benthamiana）瞬时表达系统进行亚细胞定位、双荧光素酶报告基因转录活性分析和病原菌接种试验；利用VIGS技术在辣椒中沉默目标基因并进行干旱、盐和病原菌处理；采用DAB和NBT染色检测ROS积累，使用微分干涉差（DIC）显微镜测量气孔开度并计算失水速率。
3.1 辣椒CaNF-Ys的鉴定与系统发育分析：通过BLASTp搜索和保守结构域验证，共鉴定到43个CaNF-Ys，其中包含14个CaNF-YAs、20个CaNF-YBs和9个CaNF-YCs。系统发育分析将辣椒、拟南芥和水稻的113个NF-Ys分为三个亚家族，同一亚家族成员具有较近的亲缘关系。
3.2 CaNF-Ys的特征与进化分析：39个CaNF-Ys分布于11条辣椒染色体上，其中7号染色体含7个成员最多。同源基因分析在三个辣椒栽培种和三个茄科物种中分别检测到12、45、43、24、14和5对同源基因；143对同源基因中133对的Ka/Ks值小于1，表明CaNF-Ys在进化中受到强烈的纯化选择。
3.3 CaNF-Ys的基因结构与保守基序分析：基因结构分析显示CaNF-Ys含有1至8个外显子，其中12个成员不含内含子。保守基序分析发现10个基序，同一系统发育分支的成员具有相似的基序组成。多序列比对显示所有CaNF-Ys均包含异源二聚化结构域和DNA结合结构域，其中NF-YA亚基的DNA结合核心区高度保守，三个组氨酸和三个精氨酸在所有CaNF-YAs中完全保守。
3.4 CaNF-Ys的顺式与转录后调控分析：启动子区共检测到56种顺式作用元件，其中光响应元件种类最多、分布最广；激素响应元件以脱落酸响应元件为主；胁迫响应元件中氧化胁迫响应元件ARE最为丰富。miRNA预测分析发现12个辣椒miRNA通过剪切或翻译抑制靶向8个CaNF-Y基因。三维结构预测显示CaNF-YAs具有典型的α-螺旋-α-螺旋结构，且比CaNF-YBs和CaNF-YCs更保守。
3.5 CaNF-Ys的转录组表达谱分析：在不同组织和胁迫条件下的表达谱显示，多个CaNF-Ys在叶片、果实、花和根中具有组织或发育阶段特异性表达；在非生物胁迫下，部分成员受甘露醇、NaCl、高温和低温显著诱导。
3.6 生物与非生物胁迫下CaNF-Ys的RT-qPCR分析：在干旱胁迫下，CaNF-YA3/10、CaNF-YC8/9呈持续上调趋势，CaNF-YA7和CaNF-YB2/14/16先升后降；在盐胁迫下，CaNF-YA7随时间持续上调。在胶孢炭疽菌（C. capsici）和辣椒疫霉（P. capsici）侵染下，不同CaNF-Y成员的表达模式呈显著差异。
3.7 CaNF-YA7在细胞核中发挥激活作用，而CaNF-YB14和CaNF-YC8抑制转录：GFP融合表达证实三个蛋白均定位于细胞核；酵母转录激活试验和双荧光素酶试验表明CaNF-YA7具有转录激活活性，CaNF-YB14和CaNF-YC8具有转录抑制活性。
3.8 CaNF-YA7和CaNF-YB14减弱抗病性，而CaNF-YC8增强抗病性：在本氏烟草中瞬时表达CaNF-YA7和CaNF-YB14分别使病斑面积增加27.4%和73.4%，CaNF-YC8使病斑面积减少28.4%；DAB/NBT染色显示ROS积累与病斑变化趋势一致。在辣椒中沉默CaNF-YA7和CaNF-YB14后病斑面积分别减少32.9%和20.5%，沉默CaNF-YC8后病斑面积增加57.5%，表明CaNF-YA7和CaNF-YB14促进病原菌定殖而CaNF-YC8抑制定殖。
3.9 CaNF-YA7是盐和干旱耐受性的候选正调控因子：在本氏烟草中过表达CaNF-YA7显著降低叶片失水速率（17.9%和24.7%）、减小气孔开度（86.7%和82.5%）并减少ROS积累；在辣椒中沉默CaNF-YA7则显著加重萎蔫、增加失水速率和气孔开度，并促进ROS积累。CaNF-YB14和CaNF-YC8在干旱和盐胁迫下未表现出显著效应。
讨论部分总结了CaNF-Ys在辣椒及茄科物种中的进化保守性和纯化选择特征，指出串联重复可能促进了基因家族的扩张。启动子顺式元件和miRNA靶向关系提示CaNF-Ys受多重因素调控。通过比较不同物种中NF-Y的功能，研究人员认为CaNF-YA7可能通过调节气孔运动、减少水分损失和降低ROS积累来增强干旱和盐耐受性，其机制可能与植物激素信号通路相关，但尚需进一步验证三个亚基之间的物理互作以及完整的NF-Y异源三聚体复合物在辣椒中的调控模式。
研究结论为：共鉴定到43个CaNF-Ys，包括14个CaNF-YAs、20个CaNF-YBs和9个CaNF-YCs。CaNF-Ys在辣椒栽培种和茄科物种中高度保守，并受到强烈的纯化选择压力。CaNF-Ys的表达广泛受非生物和生物胁迫诱导。CaNF-YA7、CaNF-YB14和CaNF-YC8定位于细胞核，其中CaNF-YA7具有转录激活活性，CaNF-YB14和CaNF-YC8具有转录抑制活性。CaNF-YA7和CaNF-YB14可能促进病斑扩展，而CaNF-YC8可能抑制病斑扩展。CaNF-YA7是干旱和盐胁迫应答的候选正调控因子，可能通过减小气孔开度从而减少水分损失来增强植物的耐盐和抗旱性；而CaNF-YB14和CaNF-YC8在所测试的非生物胁迫条件下未表现出明显效应。
