《Poultry Science》：Black Soldier Fly Larvae Meal Supports Intestinal Integrity and Reduces Jejunal
Clostridium perfringens Counts in Broilers Challenged with Necrotic Enteritis
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本研究旨在评估饲粮中添加黑 soldier fly larvae（BSFL；Hermetia illucens）粉对坏死性肠炎（NE）攻毒肉鸡的生长性能、肠道健康、免疫反应、体成分及盲肠微生物区系的影响。共选取504只1日龄雄性Cobb 500肉鸡，随机分为6
本研究旨在评估饲粮中添加黑 soldier fly larvae（BSFL；Hermetia illucens）粉对坏死性肠炎（NE）攻毒肉鸡的生长性能、肠道健康、免疫反应、体成分及盲肠微生物区系的影响。共选取504只1日龄雄性Cobb 500肉鸡，随机分为6个处理组，每组6个重复，每个重复14只鸡：未攻毒阴性对照组（NC）、攻毒对照组（CC），以及CC分别添加2.5%、5.0%、7.5%或10.0% BSFL粉组。于第14天以Eimeria maxima攻毒，第18天以NetB阳性Clostridium perfringens攻毒。NE攻毒降低了Eimeria接种后6天（dpi；P = 0.007）的体重及攻毒后早期（0–6 dpi；P < 0.001）的体增重。随BSFL添加量从0增至6 dpi（P = 0.007）和0至8 dpi（P = 0.015），采食量呈线性增加。在6 dpi（P = 0.003）和8 dpi（P < 0.001），绒毛高度随BSFL添加呈线性增加，空肠C. perfringens数量（P = 0.023）和血清FITC-d浓度（P = 0.039）在6 dpi呈线性降低。OCLN表达在6 dpi对BSFL添加呈显著二次响应（P = 0.018），而JAM2、ZO2和MUC2未受影响。类似地，IFNG和IL1β的mRNA表达在攻毒鸡中升高，并在6 dpi对BSFL添加呈二次响应（分别为P = 0.012和P = 0.024）。在8 dpi，两个基因均随BSFL添加呈线性增加（P = 0.003和P = 0.004）。体成分、骨骼相关参数及盲肠α多样性未受处理影响（P > 0.05）。基于Weighted UniFrac或Bray–Curtis距离的β多样性未观察到差异（P > 0.05），尽管Unweighted UniFrac和Jaccard距离存在显著差异（P = 0.001）。综上，饲粮BSFL粉在NE攻毒期间改善了肠道形态和屏障功能，同时降低了C. perfringens定植。这些结果表明，BSFL粉可能作为一种有前景的功能性饲料原料，在肠道攻毒条件下支持肉鸡肠道健康与抵抗力。
研究背景方面，坏死性肠炎（NE）是肉鸡最重要的经济性肠道疾病之一，全球年损失估计接近60亿美元。其致病因子为产毒素的产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens），该菌为革兰氏阳性厌氧菌，在健康肠道中定植，但当肠道稳态被破坏时转为致病。其成孔NetB毒素是关键毒力因子，可损伤上皮膜并诱导组织坏死。该病呈临床型和亚临床型，亚临床型在商业鸡群中更普遍且常因无明显症状而难以在群体水平被发现，造成生长和饲料效率下降。病变见于小肠，尤其是空肠，上皮损伤损害营养吸收并破坏屏障完整性。NE的发生很少仅由C. perfringens单独引起，而是肠道损伤、微生物失衡和有利于细菌增殖的日粮条件之间相互作用的结果。其中，与Eimeria共感染起核心作用，特别是E. maxima与C. perfringens组合时协同致病性最强。多年来，抗生素促生长剂被广泛用于控制NE和维持肠道健康，但对抗菌素耐药性的担忧导致许多国家限制其在动物饲料中的使用。去除抗生素后，支持攻毒条件下肠道抵抗力的营养策略重要性增加，但现有策略效果常不一致，因为NE通过多条相互作用途径发展。因此，能同时影响多个生物学过程的饲料原料可能提供更可靠的保护。黑 soldier fly（Hermetia illucens）幼虫（BSFL）因其营养和生物学特性组合而受到关注。除提供高消化率蛋白质外，还含有脂质、结构多糖和抗菌肽等生物活性化合物。其脂质部分尤其富含月桂酸，一种对包括C. perfringens在内的有害革兰氏阳性菌具有抗菌活性的中链脂肪酸。此外，BSFL含几丁质等结构成分，可与肠道免疫反应和肠道微生物群落相互作用。BSFL还含cecropins、defensins和attacins等抗菌肽，在体外对多种革兰氏阳性和阴性病原体有活性。尽管有这些潜力，NE攻毒条件下BSFL的信息仍然有限。以往多数研究将BSFL作为蛋白质来源评估其替代豆粕的效率，而非在肠道稳态被破坏后其功能如何。因此，研究人员评估了饲粮BSFL作为豆粕部分替代物对E. maxima和C. perfringens攻毒肉鸡生长性能、肠道完整性和疾病严重程度的影响。研究人员假设BSFL会限制C. perfringens增殖、减少病变发展并有助于在共感染期间保持屏障完整性。
研究人员开展的研究为：选用504只1日龄Cobb 500雄性肉鸡，随机分为6组，每组6重复，每重复14只。日粮处理包括基于玉米-豆粕（SBM）的非攻毒阴性对照（NC）和五个NE攻毒组，分别接受SBM基础对照日粮或含2.5%、5.0%、7.5%、10.0% BSFL粉的日粮。所有日粮配制成玉米-SBM粉料并满足或超过Cobb 500营养规格。研究采用E. maxima–C. perfringens序贯攻毒模型诱导NE。第14天，所有攻毒组鸡经口灌胃接种10,000个E. maxima株41A孢子化卵囊；第18天（4 dpi），每只鸡经口灌胃接受1 mL含1 × 10? CFU NetB阳性C. perfringens株Del-1的接种物。非攻毒鸡在第14天和第18天接受等体积（1 mL）无菌PBS。于第20、21和22天（分别为6、7和8 dpi）在Meckel憩室远端标准化空肠段评估大体肠道病变，采用4分制评分（0 = 无病变；1 = 轻度；2 = 中度；3 = 重度）。5–7 dpi被认为急性攻毒后期，8–14 dpi为恢复期。主要关键技术方法包括：使用FITC-d（4 kDa）评估肠道通透性；空肠食糜和盲肠内容物中C. perfringens菌落计数（TSC/SFP琼脂厌氧培养72 h）；空肠和回肠组织组织形态学测量（VH、CD及VH:CD）；空肠组织定量实时PCR（qRT-PCR）检测紧密连接蛋白、黏蛋白、细胞因子和宿主防御肽基因表达，以ACTB为参照基因，采用2
?ΔΔCt法计算相对mRNA表达；使用双能X射线吸收法（DEXA）进行体成分分析；盲肠食糜16S rRNA基因V3–V4区域扩增测序及QIIME2/DADA2生物信息学分析；以及包括单因素方差分析、Tukey HSD检验、正交多项式对比、Fisher精确检验、Kruskal–Wallis检验和PERMANOVA在内的统计学分析。样本队列来源为商业孵化场获得的Cobb 500肉鸡，饲养于University of Georgia家禽研究中心。
研究结果如下：
生长性能：14日龄体重各组无显著差异。20日龄（6 dpi），CC和CC2.5体重显著低于NC，CC5、CC7.5和CC10居中间（P = 0.007）。22日龄（8 dpi），所有攻毒组体重均显著低于NC（P < 0.001），攻毒组间无显著差异。0–6和0–8 dpi，所有攻毒组体增重显著低于NC（P < 0.001），BSFL添加组相对CC无显著差异。0–6 dpi（P = 0.007）和0–8 dpi（P = 0.015）采食量随BSFL添加呈线性增加。饲料转化率各期无显著差异。
每日采食量：1–4 dpi各组无差异；5–8 dpi所有攻毒组低于非攻毒组（P < 0.001）。5 dpi时NC采食量最高，CC最低，CC10在攻毒组中最高且显著高于CC（P < 0.05）。9–14 dpi采食量逐渐恢复，组间无差异。
肠道形态：6 dpi空肠绒毛高度CC低于NC（P = 0.006），随BSFL添加呈线性增加（L = 0.003）；隐窝深度CC大于NC（P < 0.001）；VH:CD比CC低于NC（P < 0.001），无剂量依赖响应。6 dpi回肠VH和CD无差异，但VH:CD比CC低于NC（P = 0.003）。8 dpi空肠VH CC低于NC（P < 0.0001），随BSFL添加呈线性增加（P < 0.001），CC10最高；空肠CD CC大于NC（P = 0.003），呈线性和二次响应（L = 0.023，Q = 0.002），CC10最大；VH:CD比CC低于NC（P < 0.001），无显著剂量效应。8 dpi回肠VH无总体处理效应（P = 0.076）但攻毒组间呈线性增加（L = 0.023）；回肠VH:CD比CC低于NC（P = 0.002），随BSFL添加呈线性增加（L = 0.007）。
大体病变评分：各时间点病变评分分布组间无差异。6和8 dpi所有组无3分（重度）病变。7 dpi仅CC和CC2.5组出现3分病变，5%、7.5%和10% BSFL组无3分病变，但差异不显著。
产气荚膜梭菌菌落计数：6 dpi，CC空肠食糜C. perfringens数量显著高于NC（P < 0.01），攻毒组间随BSFL添加呈显著线性下降（L = 0.023），但无BSFL组与CC有显著差异。6 dpi盲肠内容物CC显著高于NC（P = 0.003），BSFL组相对CC无显著差异。8 dpi空肠C. perfringens CC仍显著高于NC（P = 0.041），BSFL组居中间且与两者均无显著差异；盲肠CC仍显著高于NC（P < 0.001），BSFL组相对CC无显著差异。
肠道通透性：6 dpi，CC肠道通透性显著高于NC（P = 0.012），攻毒组间随BSFL添加呈显著线性下降（L = 0.039）。CC2.5与CC相似，CC5、CC7.5和CC10居中间且与CC或NC均无差异。7 dpi各组无差异（P = 0.059）。
紧密连接蛋白和黏蛋白基因表达：6 dpi，OCLN表达CC显著低于NC（P = 0.025），攻毒组间呈显著二次响应（Q = 0.018），中间BSFL水平显示部分恢复；JAM2、ZO2和MUC2各组无显著差异。8 dpi，OCLN、JAM2、ZO2和MUC2各组均无显著差异，攻毒组间无线性或二次趋势。
炎性细胞因子和宿主防御肽基因表达：6 dpi，IFNG表达CC显著高于NC（P = 0.001），攻毒组间呈显著二次响应（Q = 0.012）；IL1β表达CC高于NC（P = 0.002），攻毒组间呈显著二次响应（Q = 0.024）；IL10表达CC高于NC（P = 0.004），BSFL组间无线性或二次趋势；AvBD3表达CC低于NC（P = 0.013），攻毒组间无显著剂量响应；LEAP2和AvBD9不受处理影响。8 dpi，IL1β表达CC10高于CC（P = 0.021），攻毒组间呈显著线性增加（L = 0.004）；IL10表达CC低于NC（P = 0.002），BSFL组间无显著趋势；IFNG总体模型不显著（P = 0.068）但攻毒组间随BSFL添加呈线性增加（L = 0.003）；LEAP2、AvBD3和AvBD9各组无差异。
体成分：7 dpi，BMD、组织脂肪百分比、总组织重量、脂肪量、瘦肉量、瘦肉百分比、BMR和骨面积均无显著处理效应（P > 0.05）。BMC未受显著影响（P = 0.053）。各体成分和骨骼相关参数均未检测到显著线性和二次响应。
盲肠微生物区系α和β多样性：6 dpi，Chao1指数（P = 0.728）、Shannon指数（P = 0.529）、Observed Features（P = 0.465）和Faith's系统发育多样性（P = 0.175）各组均无显著差异。β多样性方面，Weighted UniFrac（P = 0.579）和Bray–Curtis（P = 0.080）无显著差异，但Unweighted UniFrac（P = 0.001）和Jaccard距离（P = 0.001）存在显著分离，表明NE攻毒和BSFL添加与微生物分类群存在与否的差异相关而非相对丰度差异。
盲肠细菌门和科相对丰度：门水平上，Bacillota为所有组优势门（约75–85%），其次为Bacteroidota和Pseudomonadota。CC组Pseudomonadota数值上较高且变异性较大，但组间无统计学显著差异（KW：χ2 = 8.94，P = 0.112）。科水平上，Lachnospiraceae和Ruminococcaceae为最丰富科，其次为Bacteroidaceae和Lactobacillaceae，Enterobacteriaceae和Oscillospiraceae也以较低比例检出，总体科水平结构各组 broadly 相似，无统计学显著差异。
讨论部分总结：攻毒组鸡在6和8 dpi体重和体增重降低，符合预期。BSFL饲喂鸡体重和体增重与攻毒对照无差异，FCR未受影响，但0–6和0–8 dpi采食量随BSFL添加线性增加，提示BSFL有助于鸡在急性攻毒后期维持采食量，但该响应不足以在短攻毒后期改善生长。尽管无显著差异，BSFL饲喂鸡14 dpi比攻毒对照重67–101 g，其中一半以上差异出现在8–14 dpi之间，与8 dpi空肠绒毛高度和回肠VH:CD线性增加一致，可能支持恢复期营养吸收。但此时体重变异性高，该模式需更多重复或更长恢复期研究确认。以往剂量响应研究中5% BSFL改善生长性能而超过10%无额外益处，更高添加增加日粮几丁质可能降低养分消化率。BSFL对肠道完整性显示一致益处：攻毒鸡空肠绒毛高度降低、隐窝加深、血清FITC-d通透性增加，而BSFL添加在急性攻毒后期部分减轻这些效应，6 dpi绒毛高度线性增加、血清FITC-d线性降低。这些保护效应可能与BSFL中生物活性化合物特别是月桂酸、几丁质和抗菌肽有关。紧密连接基因中仅OCLN响应BSFL，2.5–7.5%添加部分恢复而10%无恢复，JAM2和ZO2未受影响，提示BSFL通过维持现有组织结构和屏障功能而非主要转录上调影响上皮完整性。MUC2表达基本不变，本研究中攻毒相对温和短暂可能未影响黏蛋白动态。空肠C. perfringens计数6 dpi随BSFL添加线性降低，提示BSFL可能限制急性攻毒后期早期细菌增殖，而盲肠计数未受影响。病变严重程度7 dpi达峰、8 dpi下降，表明向恢复进展。尽管病变评分分布组间无统计学差异，7 dpi重度（3分）病变仅见于攻毒对照和2.5% BSFL组，5%、7.5%和10%添加组无重度病变。细胞因子方面，攻毒对照IFNG和IL1β表达升高，BSFL饲喂鸡6 dpi IFNG和IL1β二次降低可能表明急性炎症反应部分减弱。宿主防御肽中AvBD3在攻毒对照6 dpi降低，但BSFL未显著恢复AvBD3表达，AvBD9和LEAP2未受日粮处理影响，提示BSFL对肠道健康的正面效应与降低病原负荷和改善肠道完整性相关而非增加HDP表达。盲肠微生物区系稳定，α多样性各组无显著差异，β多样性Unweighted UniFrac和Jaccard显著分离而Weighted UniFrac和Bray–Curtis无差异，提示NE攻毒和BSFL添加通过低丰度分类群变化影响细菌群落组成而未大幅改变优势盲肠细菌种群。体成分在7 dpi基本未受NE攻毒或BSFL影响，可能7 dpi为时过早，骨骼发育效应随时间更明显。综上，BSFL部分减轻急性攻毒后期肠道屏障损伤和空肠C. perfringens负荷，对免疫基因表达的影响取决于剂量和采样时间，对盲肠微生物区系影响较小。约5–7.5%可能是进一步测试的实用范围。攻毒较轻、重度病变不常见且攻毒后期短，因此病变严重程度、体成分和骨骼性状的效应未能检测到。
研究结论翻译：增加BSFL添加量与较高采食量、较大空肠绒毛高度、降低肠道通透性和较低空肠C. perfringens计数相关，尤其在6 dpi。然而，BSFL添加组与攻毒对照之间体重和体增重无显著差异。部分炎性细胞因子基因对BSFL添加显示剂量依赖响应。病变评分、体成分和盲肠α多样性未受BSFL添加显著影响，而Unweighted UniFrac和Jaccard距离检测到β多样性显著差异。BSFL添加未一致影响宿主防御肽基因表达。这些结果表明，BSFL粉可能通过降低细菌定植和维持肠道屏障完整性帮助支持肠道健康，尽管潜在机制需进一步研究。全脂BSFL粉因此可能作为无抗肉鸡生产中的功能性原料，在急性攻毒后期肠道水平获益最明显。
