基因型相同而致病性迥异——A3B2型传染性法氏囊病病毒222/20与75/11株的差异致病性及法氏囊炎症转录特征

《Poultry Science》：Differential pathogenicity of A3B2 infectious bursal disease virus strains associated with distinct inflammatory transcriptional signatures

　　

摘要翻译：新谱系传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus, IBDV）的出现，引发了对病毒基因型、致病性与宿主反应之间关系的疑问。研究人员比较了两株呈现相反临床表型的A3B2基因型毒株所诱导的致病性和法氏囊（bursa of Fabricius）转录反应：新鉴定的波兰株222/20和先前表征的高毒力野毒株75/11。对无特定病原（specific-pathogen-free, SPF）鸡的实验感染表明，222/20株尽管引起明显的法氏囊萎缩和组织病理学病变，但未引起临床症状或死亡，而75/11株引起56%死亡率。在多重比较校正后，受检组织中的病毒RNA载量在两株间无显著差异。选择感染后3天（days post-infection, dpi）以表征感染早期急性期的法氏囊RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq），相对于未感染对照，在222/20感染组鉴定出703个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），在75/11感染组鉴定出3,573个DEGs。两株均诱导干扰素相关和抗病毒转录反应。然而，75/11感染组表现出与细胞因子信号传导、炎症和细胞死亡相关的通路的更广泛富集，并伴有炎症介质和干扰素相关基因表达增加。这些发现表明，遗传相关的A3B2株尽管在测定的组织病毒RNA载量中无统计学显著差异，仍可表现出显著不同的临床致病性。75/11株更严重的表型与法氏囊中更广泛的炎症和抗病毒转录反应相关。然而，这些关联并未确立因果关系，需要额外的功能研究以确定相反致病表型背后的机制。

传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus, IBDV）是破坏鸡免疫系统、造成全球养禽业损失的重要病原。其基因组为双链RNA，分为A、B两个节段，因突变和重排而具有高度遗传变异性，已形成17个基因型和新的亚基因型；A3B2历史上与超强毒IBDV（very virulent IBDV, vvIBDV）相关，但新出现的A3B2谱系使病毒基因型、致病性和宿主反应之间的关系复杂化。波兰分子监测发现三个IBDV基因型流行，其中包括此前未识别的A3B2亚系，其特征为VP2的K221、D254和N279等氨基酸替换。既往研究提示221位变异与抗原性改变相关，279位替换与致病性改变相关，G254D和D279N也见于一株非致死但造成明显淋巴组织损伤的IBDV株。因此，新鉴定的波兰A3B2谱系的致病特征及其相关宿主转录反应尚未经实验表征。研究人员因此比较222/20与已表征的波兰A3B2野毒株75/11的致病性，并分析感染早期法氏囊转录反应，以探讨同一基因型内临床表型相反的毒株与宿主反应及疾病严重度的关系。研究结果表明，222/20虽引起明显法氏囊萎缩和病变，却无临床症状和死亡；75/11引起56%死亡率；校正后组织病毒RNA载量无显著差异；法氏囊转录组显示两株均诱导干扰素和抗病毒反应，而75/11具有更广泛的炎症、细胞因子信号和细胞死亡通路富集。该研究的重要意义在于揭示遗传相关A3B2株可呈现显著不同的临床致病性，并提示更严重表型与法氏囊更广泛的炎症和抗病毒转录反应相关，但作者明确指出关联不等同于因果关系。

关键技术方法概括：使用两株波兰A3B2 IBDV，222/20/Poland/2020和75/11/Poland/2011；60只3周龄SPF白来航鸡（Valo BioMedia，德国）随机分为G1、G2各25只和G3 10只，G1/G2分别眼内接种10⁵ EID₅₀/bird的222/20和75/11，G3接种生理盐水；每日观察10天，3 dpi每组5只安乐死采样，余存活鸡10 dpi安乐死。采集法氏囊、脾、胸腺、盲肠扁桃体、肾、肝、十二指肠、腺胃及泄殖腔拭子；计算法氏囊/体重指数（bursa-to-body-weight index, BBIX）和脾/体重比，法氏囊苏木精-伊红（haematoxylin and eosin, H&E）组织病理评分；3 dpi法氏囊RNA-seq（每组n=5）行差异表达及基因本体（Gene Ontology, GO）/京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析，逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR）验证8个DEGs并检测病毒RNA载量；采用相应参数或非参数统计并多重比较校正。

研究结果：比较氨基酸序列分析（Comparative amino acid sequence analysis）通过VP1–VP5成对比较发现两株间有20个氨基酸替换，序列一致性从VP4的97.53%至VP1的99.43%；VP2存在Q221K、G254D和D279N，VP1、VP3、VP4和VP5亦有差异。致病性研究（Pathogenicity study）通过10天SPF鸡实验显示，222/20组无临床症状和死亡，75/11组在2–5 dpi出现沉郁、羽毛蓬乱、腹泻和不愿活动，25只中14只死亡（56%）；生存分析三组差异显著，75/11组生存显著低于222/20组和对照组，222/20组与对照组无差异；两感染组均有脾肿大伴斑驳、肾肿胀、法氏囊和胸腺萎缩，脾/体重比高于对照，BBIX随时间下降且组间无显著总体差异，体重无显著差异；8种组织2个时间点共16个比较经Holm校正后病毒RNA载量无显著差异，肾和十二指肠在10 dpi数值上222/20较高但校正后p=0.1270；10 dpi法氏囊组织病理评分感染组高于对照，两组间无显著差异，滤泡耗竭为主，75/11组两个样本见局灶坏死和结缔组织内淋巴样细胞浸润。转录组分析（Transcriptome analysis）通过3 dpi法氏囊RNA-seq（478,319,126条原始reads，404,360,724条clean reads，84.5%）发现，DESeq2鉴定222/20组703个DEGs（557上调、146下调），75/11组3,573个DEGs（2,960上调、613下调），两组直接比较2,323个DEGs；GO富集在222/20组和75/11组分别有140和290个显著term（BP/CC/MF分别为128/9/3与259/16/15）；两株均富集免疫系统过程、免疫反应、防御反应、先天免疫反应、免疫调节和炎症反应，75/11组在分子功能上更广，包括细胞因子活性、细胞因子结合、细胞因子受体活性、免疫受体活性和I型干扰素受体结合；共享关键基因包括STAT1、IFIH1、DDX60、RSAD2、IL6和CCL4，75/11组额外涉及IFNW1、IFNG、CSF3和SOCS3；KEGG共享细胞因子-细胞因子受体互作、单纯疱疹病毒1感染、NOD样受体信号、流感A、Toll样受体信号、胞质DNA感知和细胞黏附分子，75/11组另有坏死性凋亡、RIG-I样受体信号、凋亡和C型凝集素受体信号，222/20组仅吞噬体通路富集。RT-qPCR验证（Verification of DEGs using RT?qPCR）通过8个DEGs显示，SCN9A和MYH7B在两感染组显著下调，IFIT5、OASL和CCL4显著上调且组间无显著差异；IL6在两感染组升高且75/11组高于222/20组；IFNW1仅75/11组高于222/20组和对照组，222/20组与对照无显著差异；CCLL4在两感染组升高且75/11组显著高于222/20组；结果与RNA-seq高度一致。

讨论部分总结：作者指出，IBDV突变和重排可获得影响免疫逃逸、宿主复制和环境传播的遗传变化；A3B2历史上与vvIBDV相关，但新A3B2亚系VP2的PBC、PDE和PFG环替换中D279N值得关注，既往与适应、致弱和降低致病性相关，但其效应依赖VP2序列和病毒遗传背景；222/20与75/11另有Q221K和G254D，G254D和D279N也见于非致死A3B3株，但这些替换的单独贡献未知，需反向遗传和定向突变研究。致病性试验中222/20临床轻但法氏囊损伤明显，病毒RNA载量校正后无显著差异；RT-qPCR不能区分感染性病毒与非感染性RNA，10 dpi仅检测存活鸡可能存在生存相关选择偏倚，转录组仅限3 dpi法氏囊，不能直接联系非淋巴组织10 dpi载量。中国A3B2低致病性株也共享D279N，提示不同遗传背景可独立出现相似表型；亚临床感染可能造成未被发现的传播，并引发对潜在免疫抑制效应的担忧，但免疫功能、疫苗保护和生产性能未评估。75/11组更广泛的免疫、炎症和细胞死亡通路富集提示更广泛的转录反应，但通路富集不等于功能激活；DEG数量差异可能反映严重度和进展，也受细胞组成影响；STAT1、IFIH1、RSAD2及IFNG、IL6和趋化因子更强诱导提示更强的抗病毒和炎症转录反应，但不能证明免疫细胞募集或组织损伤；凋亡和坏死性凋亡通路与75/11组局灶坏死一致，但转录组和组织病理时间点不同，不能建立机制；222/20组无这些通路富集不排除其参与法氏囊萎缩；10 dpi组织病理两组无显著差异需谨慎解释；单时间点、单组织和无蛋白水平验证限制结论。研究结论部分翻译：总之，222/20株尽管具有较高病毒RNA载量和明显法氏囊病变，却引起亚临床感染。比较转录组分析显示，两株A3B2均诱导共享的抗病毒反应，而vvIBDV株75/11感染与炎症、细胞因子信号传导和细胞死亡通路的更广泛富集相关。相反，222/20株显示出较不广泛的炎症转录谱。总体而言，这些发现表明75/11更严重的临床表型与法氏囊中更强的炎症和抗病毒转录反应之间存在关联。这种增强的免疫激活可能促进IBDV免疫病理；然而，本研究单组织、单时间点的转录组分析不能确立因果关系。