苯并噁唑及溴/氟取代席夫碱的结构相关生物分子相互作用与生物活性

《Results in Chemistry》：Structure-related biomolecular interactions and biological activities of benzoxazole and bromo/fluoro-substituted Schiff bases

　　

合成了两种席夫碱化合物——N-(苯并[d]噁唑-2-基)-1-(吡啶-2-基)甲亚胺（ABPC）和2-((4-溴萘-1-基)亚氨基甲基)-4-氟苯酚（FABN），并采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、¹H和¹³C核磁共振（NMR）波谱，结合高分辨质谱（HRMS）对其结构进行了确证。通过溴化乙锭（EtBr）置换实验、同步荧光光谱、稳定性评估、抗菌实验及体外抗炎研究，对二者的生物分子相互作用及生物功能进行了比较分析。紫外-可见（UV–Vis）吸收研究表明，两种化合物主要通过沟槽结合机制与小牛胸腺DNA（ct-DNA）结合，其中FABN表现出比ABPC更强的DNA结合亲和力（4.93 × 10⁶ M^?1 vs 1.97 × 10⁶ M^?1）。荧光分析表明，两种物质均通过静态猝灭过程与人血清白蛋白（HSA）相互作用，稳定性评估证实了二者在生理环境中的稳健性。两种物质对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出浓度依赖性抗菌效应，并在白蛋白变性实验中表现出中等抗炎活性。上述结果强调了结构变异对生物分子相互作用及生物功能的影响，同时为相关席夫碱衍生物的设计提供了指导。

研究背景：席夫碱是一类结构多样、易于合成且具有广泛生物活性的有机分子，其特征性亚甲胺（-C=N-）基团可与生物大分子发生氢键、π-π堆积、静电作用等非共价相互作用，因而可通过化学结构修饰调控其生物活性。含苯并[d]噁唑骨架的席夫碱因具有刚性平面稠合杂芳环结构及氮、氧供体原子而备受关注，该类结构有助于增强生物分子相互作用，并与抗菌、抗癌、DNA及蛋白结合等性质相关。此外，卤素原子（尤其是溴和氟）的引入可显著影响化合物的理化行为与生物活性谱：溴具有高度可极化性和亲脂性，可参与范德华及疏水相互作用；氟则可调节电子性质、亲脂性及分子体系稳定性。然而，此类结构特征对生物分子相互作用的影响难以通过孤立分子性质分析加以评估，因此在相同实验条件下对结构相关的席夫碱进行比较研究，对于识别结构-性质/活性关系至关重要。尽管已有许多席夫碱衍生物被用于DNA或蛋白结合研究，但较少有研究在比较性研究中同时涵盖结构表征、光物理研究、DNA与鸟嘌呤识别、HSA相互作用、互补荧光分析、生理稳定性及生物学评价。为此，研究人员在相同实验条件下将一种基于苯并[d]噁唑的席夫碱与一种相应的溴/氟取代萘基席夫碱进行比较，以更好地理解杂芳环结构、平面性、氢键能力及卤素取代的影响。

研究人员开展了以下研究：合成了两种新型席夫碱ABPC（苯并[d]噁唑-吡啶亚胺结构）和FABN（溴化萘基连接氟苯酚骨架），并通过¹H/¹³C NMR、FT-IR及HRMS确证结构，同时在1% DMSO溶液中考察其光物理性质（吸收与发射极大值及量子产率），并测定其辛醇-水分配系数（logP）以评估亲脂性。主要目标是系统评价两种不同席夫碱结构在相同实验条件下对生物分子识别及生物活性的影响：通过UV–Vis吸收滴定评估二者与ct-DNA的相互作用并测定DNA结合常数，通过EtBr置换实验评估DNA结合模式；通过鸟嘌呤结合实验评估各化合物与单一核碱基的相互作用；通过荧光猝灭测定及同步荧光光谱研究二者与HSA的相互作用，评估Tyr和Trp-214残基微环境变化；将两种化合物在pH 7.4的Tris-HCl缓冲液、水及含谷胱甘肽（GSH）介质中孵育72 h，测定其光谱稳定性；采用琼脂孔扩散法测试对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌性能；采用白蛋白变性体外实验评估抗炎性能。

结论：两种席夫碱ABPC和FABN成功合成并经¹H/¹³C NMR、FT-IR及HRMS确证结构。UV–Vis吸收分析表明二者主要经沟槽结合机制与ct-DNA相互作用，FABN的DNA结合亲和力（Kb = 4.93 × 10⁶ M^?1）高于ABPC（Kb = 1.97 × 10⁶ M^?1），且二者均与鸟嘌呤有显著结合。荧光研究表明二者均通过静态猝灭机制与HSA结合，约含一个结合位点。光谱稳定性分析表明ABPC和FABN在所考察的生理条件下保持稳定。二者对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出浓度依赖性抗菌活性，并在体外抗炎实验中表现出中等程度的白蛋白变性抑制作用。该比较分析为苯并[d]噁唑及卤素取代席夫碱结构如何影响生物分子相互作用与生物功能提供了见解，并为相关席夫碱衍生物的未来设计与生物学评价奠定了基础。重要意义在于：上述结果为设计及评价更多具有生物活性的席夫碱提供了依据，并揭示了结构变异对DNA和蛋白识别性质、稳定性及生物响应的影响。

关键技术方法：研究人员采用缩合反应合成两种席夫碱（苯并[d]噁唑-2-胺与吡啶-2-甲醛缩合制备ABPC；1-氨基-4-溴萘与5-氟水杨醛缩合制备FABN），经¹H/¹³C NMR、FT-IR及HRMS进行结构表征；采用UV–Vis吸收光谱与荧光光谱测定光物理性质及logP；通过UV–Vis吸收滴定测定ct-DNA结合常数，EtBr置换实验评估结合模式，鸟嘌呤滴定评估核碱基识别；通过荧光猝灭及同步荧光光谱研究HSA结合；在Tris-HCl缓冲液、水及GSH介质中评估光谱稳定性；采用琼脂孔扩散法评价抗菌活性，白蛋白变性抑制实验评价抗炎活性。研究所用HSA、EtBr等试剂购自HiMedia Laboratories，菌株为临床分离的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。

研究结果：（1）合成与表征：ABPC经苯并[d]噁唑-2-胺与吡啶-2-甲醛在甲醇中65 °C回流24 h缩合制得，产率86%；FABN经1-氨基-4-溴萘与5-氟水杨醛缩合制得，产率78%。¹H NMR中ABPC的亚胺HCN质子出现在δ 9.31 ppm，FABN在δ 9.03 ppm出现尖单峰，原料醛基质子完全消失；FABN在δ 12.23 ppm出现酚羟基ArOH信号，提示OH···N=C强分子内氢键；¹³C NMR中ABPC亚胺碳信号在163.17 ppm；FT-IR中ABPC与FABN的C=N亚胺伸缩振动分别位于1647 cm^?1和1616 cm^?1，ABPC的C-O-C伸缩在1246 cm^?1，FABN的C-F伸缩在1141 cm^?1、C-Br伸缩在582 cm^?1；HRMS（ESI⁺）测得ABPC m/z 224.0726（计算值223.0746），FABN m/z 344.0082（计算值344.1834），共同确证了目标结构。（2）光物理性质：在1% DMSO中，ABPC在约211 nm处有强吸收带（π→π*跃迁），FABN在约226 nm处有强吸收带并于374 nm附近有第二吸收带；FABN与ABPC的发射极大值分别为449.5 nm和314 nm；ABPC量子产率（Φ = 0.61）显著高于FABN（Φ = 0.01），且高于硫酸喹啉参比（0.31）；FABN的logP（1.33）略高于ABPC（1.19），二者均具中等亲脂性。（3）DNA结合研究：随着ct-DNA浓度（0–12 μM）递增，两种化合物在特定吸收波长处吸光度系统性增加（增色效应），提示结合主要为沟槽结合及与ct-DNA磷酸骨架的静电相互作用而非经典嵌插；ABPC的Kb为1.97 × 10⁶ M^?1，FABN为4.93 × 10⁶ M^?1，FABN亲和力更高。（4）鸟嘌呤结合研究：鸟嘌呤浓度递增（ABPC 0–70 μM，FABN 0–35 μM）引起显著增色效应，归因于化合物与鸟嘌呤间NH···N或C=N···HN氢键及芳环与嘌呤环的π-π相互作用；ABPC的Kb为6.80 × 10⁶ M^?1，FABN为7.66 × 10⁶ M^?1，二者鸟嘌呤结合亲和力高且相当，均显著高于其与ct-DNA的总结合常数，提示对鸟嘌呤核碱基的选择性结合，可能反映对DNA大沟富鸟嘌呤序列的优先结合。（5）EtBr置换实验：随ABPC（0–14 μM）浓度增加，EtBr-DNA体系荧光强度下降，FABN显示相当程度的置换；Stern-Volmer猝灭常数KSV分别为ABPC 7.03 × 10³ M^?1、FABN 8.78 × 10³ M^?1，数值适中，提示置换程度低于经典嵌插剂，结合模式为沟槽结合和/或与DNA磷酸骨架的静电相互作用。（6）HSA结合研究：随ABPC和FABN浓度（0–14 μM）增加，HSA荧光强度逐渐降低且发射极大值无位移，提示经基态复合物形成发生静态猝灭；双分子猝灭速率常数Kq达10¹² M^?1 s^?1量级，远高于扩散控制极限（约10¹⁰ M^?1 s^?1），符合静态猝灭机制；FABN对HSA的猝灭效率及结合亲和力（KHSA = 1.53 × 10⁵ M^?1）高于ABPC（0.19 × 10⁵ M^?1）；结合位点数n分别为FABN 1.3、ABPC 0.9，提示二者在HSA上均有一个优先结合位点，FABN作用更强，结合位点最可能与Trp-214附近的一个主要位点一致。（7）稳定性研究：ABPC和FABN在Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）、水及GSH溶液中72 h内峰位与吸光度无明显变化，GSH溶液中无光谱变化，提示不被GSH硫醇基团亲核攻击，表明二者在三种生理条件下均高度稳定，适于体外和体内生物学评价。（8）同步荧光光谱：在Δλ = 15 nm（Tyr）和Δλ = 60 nm（Trp）处，随化合物浓度增加荧光强度持续下降但无明显峰位移，Δλ = 60 nm处猝灭效应更显著，提示二者更多作用于HSA的Trp-214环境（疏水亚结构域IIA）；峰位移很小表明发色团周围微环境总体极性未显著改变，结合过程中蛋白骨架未发生大幅构象变化。（9）抗菌活性：采用琼脂孔扩散法，以阿莫西林（0.02 mM）为阳性对照、DMSO为阴性对照。ABPC在0.04、0.08、0.13 mM下对金黄色葡萄球菌抑菌圈分别为5、7、11 mm，对大肠杆菌为5、8、12 mm；FABN在0.02、0.05、0.08 mM下对金黄色葡萄球菌抑菌圈分别为5、9、14 mm，对大肠杆菌为5、8、13 mm，活性略高于ABPC；阿莫西林抑菌圈为18 mm。FABN活性增强可能与其溴、氟取代基改变席夫碱骨架亲脂性及电子特性、促进与细菌靶标相互作用有关。（10）体外抗炎活性：采用白蛋白变性抑制实验，ABPC的IC50为190.50 μg/mL，FABN为182.65 μg/mL，阿司匹林为169.24 μg/mL；二者呈浓度依赖性抑制，在250 μg/mL时抑制率约63–65%，与阿司匹林接近；FABN略低的IC50可能归因于其酚羟基和氟取代基的额外氢键能力，增强与血清白蛋白的静电及疏水相互作用。

讨论与结论：本研究通过比较两种结构不同的席夫碱在相同实验条件下的行为，揭示苯并[d]噁唑骨架与溴/氟取代萘基骨架对DNA和蛋白识别性质、稳定性及生物响应的影响。UV–Vis吸收分析表明二者主要经沟槽结合机制与ct-DNA相互作用（增色效应及EtBr置换实验为证），FABN的DNA结合亲和力（Kb = 4.93 × 10⁶ M^?1）高于ABPC（Kb = 1.97 × 10⁶ M^?1），但二者均与鸟嘌呤显著结合。荧光研究表明二者经静态猝灭机制与HSA结合，约含一个结合位点。光谱稳定性分析表明ABPC和FABN在所考察的生理条件下保持稳定。二者对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出浓度依赖性抗菌活性，并在体外抗炎实验中表现出中等程度的白蛋白变性抑制作用。该比较分析为苯并[d]噁唑及卤素取代席夫碱结构如何影响生物分子相互作用与生物功能提供了见解，并为相关席夫碱衍生物的未来设计与生物学评价奠定了基础。