《Talanta Open》：Mixed-Mode Monolithic Pipette-Tip Micro-Solid-Phase Extraction Coupled with HPLC–UV for Rapid Determination of Urinary Serotonin
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混合模式整料移液枪头微固相萃取（PT μ-SPE）结合高效液相色谱-紫外检测（HPLC–UV）被研究人员成功开发并应用于人尿液中血清素（5-羟色胺，5-HT）的快速测定。该混合模式整料（mixed-mode monolith）同时利用阳离子交换与疏水相互作用实
混合模式整料移液枪头微固相萃取（PT μ-SPE）结合高效液相色谱-紫外检测（HPLC–UV）被研究人员成功开发并应用于人尿液中血清素（5-羟色胺，5-HT）的快速测定。该混合模式整料（mixed-mode monolith）同时利用阳离子交换与疏水相互作用实现目标分析物的高效保留。通过紫外（UV）引发聚合，研究人员仅需10 min即可在移液枪头内原位制备该整料，显著缩短了制备时间。所建立的萃取方法采用定量单次流穿模式，无需重复的吸排循环即可实现高效萃取。与疏水性C18整料相比，该混合模式整料的动态突破容量（DBC）提高了约200倍。在优化条件下，该方法在10–400 ng mL?1范围内呈现良好线性，检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为1.70 ng mL?1和5.67 ng mL?1，并获得了满意的精密度和准确度。将该方法应用于健康志愿者尿液样本，加标回收率为95.39%–104.15%。研究表明，所发展的PT μ-SPE–HPLC–UV方法为尿液中血清素的常规分析提供了一种简单、快速、经济且灵敏的样品前处理平台。
血清素（5-羟色胺，5-HT）作为关键神经递质，在情绪调节、睡眠、食欲和心血管功能等生理过程中发挥重要作用，其信号失调与抑郁症、焦虑症及类癌综合征等病理状态密切相关。因此，在血浆、血液和尿液等生物基质中准确定量血清素对临床诊断、治疗药物监测和生物医学研究至关重要。其中，尿液因其无创、简便和低成本的采集方式而被视为优选基质。然而，血清素的痕量浓度以及复杂内源性干扰物的存在，要求分析方法具备高灵敏度和高选择性。
目前常用的血清素测定技术包括免疫分析、电化学检测、毛细管电泳、高效液相色谱-紫外检测（HPLC–UV）和液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）。LC–MS/MS虽具有优异灵敏度与选择性，但仪器昂贵且需要高技能操作人员；电化学方法快速廉价却易受基质干扰和电极污染；HPLC–UV因普及率高、操作简便和运行成本低而适合常规实验室，但灵敏度相对不足，需在分析前进行高效样品前处理。传统样品前处理方法如蛋白沉淀和液液萃取虽然快速，但选择性不足，难以将血清素与其结构类似物分离。固相萃取（SPE）基于分析物与基质组分间的差异吸附提供增强的选择性，其中C18吸附剂应用最广，但血清素的极性使其疏水保留较弱，萃取效率不理想。苯硼酸功能化吸附剂虽可通过特异性相互作用增强选择性，但通常需要额外的衍生化步骤，消耗更多试剂并延长分析流程。因此，亟需一种无需衍生化即可选择性富集血清素的简单高效萃取平台。混合模式吸附剂结合疏水与离子交换相互作用，为提取极性碱性化合物提供了有吸引力的替代方案。
在课题组前期研究中，混合模式整料主要侧重于电化学传感器开发，未系统考察萃取过程。本工作中，研究人员系统优化了萃取平台，考察关键萃取参数的影响，并将其与传统C18吸附剂（包括整料和颗粒填充材料）进行性能比较，重点探究阳离子交换与疏水相互作用对萃取性能的协同贡献。血清素同时具有可质子化的伯胺基和吲哚芳香环，是静电与疏水相互作用的理想分析物。将萃取流程与常规HPLC–UV联用，萃取洗脱液可直接注入色谱系统，省去了先前电化学方法所需的干燥和复溶步骤。在优化条件下，该方法在线性、灵敏度、准确度和精密度方面均表现良好，并成功应用于人尿中血清素的测定，为使用常规HPLC–UV仪器分析尿液血清素提供了一种通用型样品制备策略。
研究人员采用紫外（UV）引发聚合技术，在表面改性的聚丙烯（PP）移液枪头内原位合成聚（甲基丙烯酸-co-二甲基丙烯酸乙二醇酯）[poly(MAA-co-EDMA)]整料。预聚合混合物由功能单体甲基丙烯酸（MAA）、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）、致孔剂1-癸醇和甲苯以及光引发剂2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPAP）组成，UV照射10 min完成聚合，整料质量约5 mg。萃取流程为：依次用甲醇和水条件化整料，将2.00 mL预处理样品以单次流穿方式上样，用800 μL含10%（v/v）乙腈（ACN）的20 mM磷酸盐缓冲液（pH 9.0）洗涤，再用150 μL含10%（v/v）ACN的20 mM磷酸盐缓冲液（pH 2.0）洗脱，洗脱液直接进HPLC–UV分析。色谱分离采用BDS Hypersil? C18柱（150 × 4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇和20 mM磷酸盐缓冲液（pH 2.0）（10:90，v/v），流速1.0 mL min?1，进样量20 μL，紫外检测波长210 nm。人尿样采自5名健康志愿者（伦理批准号：EC-65-0094），分析前用20 mM磷酸盐缓冲液（pH 9.0）两倍稀释。
**3.1 整料的制备与表征**
研究人员在200 μL、1 mL和5 mL三种不同规格的表面改性PP移液枪头内均成功通过UV引发聚合制备了poly(MAA-co-EDMA)整料，证明该制备策略具有良好的通用性。扫描电子显微镜（SEM）表征显示，整料完全占据移液枪头内径并与管壁紧密贴合，无界面间隙或收缩；高倍率图像呈现甲基丙烯酸酯类聚合物整料典型的互联球状多孔结构。该多孔骨架产生大量流通孔，有利于对流传质并提供可及的吸附表面，为高效萃取和单次流穿操作奠定了基础。
**3.2 PT整料μ-SPE萃取方法的建立**
研究系统优化了上样、洗涤和洗脱条件并阐明了混合模式保留机制。上样pH实验显示，pH 4.0时回收率较低，因为MAA羧基以质子化形式存在，难以与带正电的血清素发生阳离子交换；pH升高至7.0和9.0时回收率显著提高，此时羧基去质子化产生负电荷位点，与血清素质子化伯胺（pKa = 9.97）发生静电作用，同时吲哚环与聚合物骨架产生疏水相互作用，形成阳离子交换与疏水协同的混合模式保留。pH 9.0获得最高回收率，故选择为上样条件。洗涤优化表明，10% ACN不会明显降低回收率，而15% ACN因过度削弱混合模式相互作用导致部分解吸；洗涤体积800 μL可在有效去除基质干扰的同时保持高回收率。洗脱优化表明，pH 2.0使羧基完全质子化从而消除阳离子交换作用，但仅靠静电破坏回收率仅约65%；添加10% ACN后回收率升至约88%，说明同时削弱静电和疏水作用才能实现高效洗脱；150 μL洗脱液可获得约95%回收率。
**3.3 混合模式与传统SPE吸附剂吸附性能比较**
动态突破容量（DBC）是评价SPE吸附剂的重要参数。研究人员将poly(MAA-co-EDMA)整料与先前报道的疏水性poly(SMA-co-EDMA)整料及三种商品化硅基C18 SPE吸附剂进行了比较。结果显示，poly(MAA-co-EDMA)整料的DBC为8.0 mg g?1，比poly(SMA-co-EDMA)整料（0.04 mg g?1）高约200倍，远高于三种商品C18吸附剂（0–0.40 mg g?1）。尽管C18吸附剂的质量是整料的10–100倍，其吸附容量仍远低于混合模式整料。两种整料具有类似的连续多孔结构，DBC的巨大差异主要归因于MAA引入的羧基提供了额外的阳离子交换位点。研究还发现，在血清素萃取中吸附剂化学性质比吸附剂用量更为关键。常规C18仅依赖疏水作用，而血清素在优化上样条件下（pH 9.0）主要以质子化形式存在，纯疏水保留不足以实现强吸附。超高DBC也解释了单次流穿即可完成高效萃取的现象，并支撑了24倍富集因子的实现。此外，UV聚合仅需10 min，远短于热聚合，有利于提高制备通量和批次重现性。
**3.4 上样体积的影响、重复使用性与长期稳定性**
上样体积直接影响富集能力和分析时间。随上样体积增大，富集因子逐步提高，而萃取效率在考察范围内始终保持在约91%以上。当上样体积增至4.00 mL时获得24倍富集因子，萃取时间约10 min，展现出萃取效率与分析通量的良好平衡。重复使用性实验表明，PT整料μ-SPE装置在前9个连续萃取循环中性能稳定，峰面积相对标准偏差（RSD）仅为2.24%，第10次循环出现明显偏差，表明该整料可在研究条件下可靠重复使用至9次。长期稳定性实验显示，整料在存放6个月后萃取性能仍基本保持不变，表明其具有良好的储存稳定性，适合提前批量制备并随取随用。
**3.5 PT μ-SPE–HPLC–UV方法的分析性能**
在优化条件下，方法学验证结果表明：tip-to-tip重复性RSD为0.7%，batch-to-batch重复性RSD为3.4%，说明UV引发聚合制备过程具有良好的重现性。校准曲线在10–400 ng mL?1范围内线性良好，回归方程为y = 294.6x + 512.69，决定系数R2 = 0.9990。检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为1.70 ng mL?1和5.67 ng mL?1。连续三天测定的日间RSD为2.27%。研究人员将本方法测得的5名志愿者混合尿液中的血清素浓度（166.80 ng mL?1）与LC–MS/MS测定结果（168.00 ng mL?1）进行比较，相对差异仅0.7%，初步验证了方法的准确性。与文献报道的方法相比，尽管部分方法通过荧光检测或质谱实现了更低的LOQ，但往往依赖昂贵仪器、冗长的萃取程序、衍生化或复杂前处理。本法只需尿液简单稀释后进行单次流穿萃取即可直接进HPLC–UV分析，在灵敏度、萃取效率（91%）、回收率（95.39–104.15%）和操作简便性之间取得了良好平衡。
**3.6 尿液样本中血清素的分析应用**
研究人员将所发展的方法应用于5份健康志愿者尿液样本的分析。内源性血清素浓度范围为78.34–167.08 ng mL?1。加标100 ng mL?1血清素后，回收率为95.39%–104.15%，表明方法在实际生物基质中具有满意的准确度。代表性色谱图显示，血清素峰与内源性尿液组分分离良好，无显著干扰，说明样品制备有效去除了基质干扰并实现了血清素的有效富集。
**讨论与结论**
讨论部分指出，混合模式保留机制中阳离子交换和疏水相互作用的协同效应是获得高吸附容量和高萃取效率的关键。与传统C18吸附剂相比，poly(MAA-co-EDMA)整料在质量远小于商品化C18的情况下仍实现了更高的DBC，表明对于极性碱性化合物，吸附剂表面化学性质比吸附剂用量更重要。单次流穿萃取能力和快速UV聚合制备进一步提升了方法的实用性和制备通量。
研究结论可翻译如下：研究人员成功发展了一种混合模式poly(MAA-co-EDMA)整料PT μ-SPE结合HPLC–UV方法，用于快速测定人尿液中的血清素。该整料结合阳离子交换与疏水相互作用，其DBC比疏水性poly(SMA-co-EDMA)整料高约200倍，并显著高于商品化C18 SPE吸附剂。在优化条件下，PT μ-SPE方法实现了高萃取效率、最高24倍富集因子、良好的重复性和重复使用性、长期储存稳定性以及使用常规HPLC–UV仪器的高分析灵敏度。对人尿液样本的分析获得了满意的回收率，支持了该方法用于尿液血清素测定的可行性。整料可在10 min内通过UV引发聚合可重现地制备，为传统SPE吸附剂提供了一种实用且潜在成本效益高的替代方案。此外，通过适当修饰整料表面化学性质，该混合模式整料平台可能适用于其他带正电荷或可电离分析物，但其更广泛的适用性仍需进一步研究。
