Calafate（小檗）果渣生物精炼活性组分及其在3D打印三文鱼糊热氧化与结构稳定化中的应用

《Antioxidants》：Biorefinery of Bioactive Components from Calafate (Berberis microphylla) Pomace and Its Application in the Thermo-Oxidative and Structural Stabilization of 3D-Printed Salmon Paste

　　

本研究开发了一种基于超临界二氧化碳（supercritical CO2，scCO2）与加压液体萃取（pressurized liquid extraction，PLE）的清洁、序贯萃取生物精炼工艺，用于从Calafate（Berberis microphylla）果渣中回收亲脂性与亲水性（酚类）生物活性组分，并将该工艺应用于抑制200 °C烘烤条件下3D打印三文鱼糊中的脂质氧化以及总类胡萝卜素（以虾青素计）和多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）的保留。为此，研究人员将100、500和1000 ppm剂量的酚类提取物应用于3D打印三文鱼糊。研究结果表明，所有提取物剂量均改善了烘烤后的相对类胡萝卜素含量，其中100 ppm剂量效果最佳，而500 ppm剂量降低了次级氧化指标（K270）。质构剖面分析（texture profile analysis，TPA）显示，所施加的剂量可能涉及蛋白质-多酚相互作用，在热条件下该相互作用可稳定肌原纤维蛋白基质，从而调节各向异性收缩、质构以及食品3D几何结构的保真度。上述结果证实了该生物精炼方法作为一种可持续策略的可行性，可用于开发适用于具有高度结构和营养复杂性的健康海洋基质的天然配料。

论文解读：Calafate果渣生物精炼活性组分在3D打印三文鱼糊热氧化与结构稳定化中的应用

一、研究背景与科学问题

3D食品打印已从原型制作工具发展为先进的结构工程平台，可通过挤出式增材制造设计具有严格营养组成和空间几何结构的可食用基质。大西洋鲑（Salmo salar）因其高蛋白密度和独特的脂质谱而成为具有高商业和营养价值的打印基质，其脂肪部分富含长链omega-3多不饱和脂肪酸（PUFAs），特别是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），同时含有虾青素——一种热敏性类胡萝卜素，作为该海洋基质的主要内源抗氧化系统。

然而，海洋PUFAs中高密度的双键（含双烯丙基亚甲基）使其极易发生脂质自动氧化和热氧化，这一化学脆弱性在烘烤过程中被显著加剧——烘烤是固化结构并确保打印食品安全所必需的步骤。热量在逐层构建的三维结构中的穿透与常规致密或均质基质中的加热截然不同，产生复杂的等温线和传质剖面，加速必需脂肪酸和天然虾青素的降解。过氧化不仅引发共轭二烯和氢过氧化物的形成（初级产物），还进一步生成醛、酮等次级羰基化合物，诱导肌原纤维蛋白的平行氧化，改变界面性质，严重损害最终烘烤产品的尺寸稳定性和宏观收缩。

为填补这一技术空白，富含初级和次级抗氧化剂的功能性配料成为拦截氧化级联反应的理想机制策略。Calafate（Berberis microphylla）是巴塔哥尼亚特有的野生果实，含有极高浓度的酚类化合物，尤其是花青素和黄烷醇，具有强自由基清除能力。在生物精炼和循环生物经济范式下，该浆果加工产生的工业果渣可通过可持续的序贯萃取技术——如超临界二氧化碳（scCO₂）与加压液体萃取（PLE）的耦合——高效回收这些多酚家族。尽管挤出技术和提取物表征方面已有独立进展，但整合海洋基质3D打印、浆果副产物氧化稳定化及相关脂质降解动力学的研究仍明显缺乏。

因此，本研究旨在开发一种序贯生物精炼工艺，从Calafate果渣中回收酚类提取物，并评估该提取物对用于3D打印并经烘烤热处理的鲑鱼糊原型中脂质热氧化的保护效应，阐明化学稳定化机制及其对生物活性化合物保留和食品几何保真度的综合影响。

二、主要关键技术方法

研究人员采用了两阶段序贯绿色萃取生物精炼工艺：第一阶段使用超临界CO₂萃取（60 °C、400 bar，静态40 min后动态35 min）回收亲脂性组分，萃取动力学采用三段线性样条（spline）分段回归模型建模；第二阶段对脱脂固体残渣进行加压液体萃取（PLE），使用Dionex ASE 300单元（1500 psi），通过三因素三水平Box-Behnken响应面实验设计优化乙醇浓度（30–70% v/v）、温度（65–145 °C）和静态时间（5–15 min），以总酚含量（TPC）和DPPH抗氧化能力为响应变量，采用全局期望函数确定最优条件。萃取动力学采用修正Peleg模型拟合。酚类提取物表征包括Folin-Ciocalteu法测定TPC、DPPH自由基清除活性、氧自由基吸收能力（ORAC）测定、pH示差法测定总花青素含量，以及傅里叶变换红外光谱（FTIR/ATR）表征固体基质。3D打印样品制备使用配备60 mL注射器和0.8 mm喷嘴的3D打印机，打印20×20×20 mm立方体（层高0.8 mm，填充密度10%，打印速度120 mm/s），在200 °C对流烘箱中烘烤20 min。评估指标包括尺寸稳定性（各向异性形变、体积收缩率、形状保真度）、质构剖面分析（TPA）、CIELAB颜色分析、比消光系数（K232、K270）测定、总类胡萝卜素含量（以虾青素当量计）及脂肪酸谱分析。样品来源：冻干Calafate果渣由Patagonia Superfruits S.A.（智利艾森）提供；新鲜大西洋鲑鱼片购自智利圣地亚哥当地零售商。

三、研究结果

3.1 scCO₂萃取与动力学建模

研究人员获得14.57 ± 0.51%（干基）的油脂萃取率，相对Soxhlet法最大可萃取潜力回收效率为86.20%。动力学分析呈现典型三阶段行为，线性样条分段回归模型拟合良好（R² = 0.9990）。恒速萃取阶段（CER）初始萃取速率（kCER）为0.0919 g/min，于16.79 min结束；随后进入降速阶段（FER），于32.25 min结束，此后进入扩散控制阶段。基于过渡时间点，建议停留时间30–40 min足以回收对流主导的主要可萃取组分，避免扩散控制阶段不成比例的时间和能耗增加。

3.2 PLE萃取与实验设计

PLE动力学采用Peleg模型拟合（R² adj = 0.9874），速率常数k1为0.0036165 cycle·g·mg^?1，对应初始萃取速率276.51 mg·g^?1·cycle^?1；容量常数k2为0.0239586 g·mg^?1，定义最大渐近产率41.74 mg GAE/gdw。首个循环即回收约87%的预测渐近产率，第三至第五循环间净增益不足2 mg GAE/gdw，表明第三循环后固体基质已基本耗尽，据此建立单循环萃取方案。Box-Behnken优化结果显示TPC模型（R² = 96.37%）由温度正线性效应主导，其次为乙醇浓度与温度的负交互作用；DPPH模型（R² = 98.54%）以乙醇-温度负交互作用为主导项。全局最优（d = 1.0）位于30.53% v/v乙醇、144 °C、10.7 min；施加80–90 °C温度操作约束后，受限最优（d = 0.7097）位于70.00% v/v乙醇、80 °C、6.57 min，预测DPPH为128.98 μmol TE/gdw、TPC为46.55 mg GAE/gdw。

3.3 脂质提取物表征

scCO₂萃取油中多不饱和脂肪酸（PUFAs）占68.86 ± 0.53%，饱和脂肪酸（SFAs）占9.07 ± 0.35%。PUFA部分以α-亚麻酸（C18:3n3，38.20 ± 0.43%）为主，其次为亚油酸（C18:2n6，30.66 ± 0.11%），omega-6与omega-3比值为1:1.25。单不饱和脂肪酸（MUFAs）占22.06 ± 0.46%，全部为油酸（C18:1n9）。油的颜色参数为L* = 24.46、a* = ?9.24、b* = 39.73，呈暗色带黄绿色调。

3.4 酚类提取物表征

全局优化条件（144 °C、10.7 min、30.5% v/v乙醇）下TPC为48.61 ± 4.94 mg GAE/gdw，受限条件（80 °C、6.6 min、70.0% v/v乙醇）下为44.63 ± 1.36 mg GAE/gdw，两者无显著差异。DPPH活性分别为147.72 ± 10.64和143.03 ± 7.69 μmol TE/gdw，亦无显著差异。但ORAC值差异显著：受限条件为2624.21 ± 97.27 μmol TE/gdw，约为全局条件（1380.27 ± 274.26 μmol TE/gdw）的1.9倍。总花青素含量从全局条件的51.90 ± 6.77 mg C3G/100 gdw大幅增至受限条件的763.34 ± 10.55 mg C3G/100 gdw，表明低温高乙醇条件更有利于热敏性花青素的保留。

3.5 FTIR表征

FTIR光谱显示，从原料到scCO₂滤饼，1740 cm^?1处与甘油三酯和酯类C=O伸缩相关的信号强度显著下降，与超临界萃取脱脂性质一致。1650–1500 cm^?1区域中scCO₂滤饼与PLE滤饼光谱高度相似，未见可归因于额外酚类萃取的整体变化。1200–800 cm^?1区域中1020–1030 cm^?1信号在PLE滤饼中相对占优，归因于细胞壁多糖（C-O/C-O-C）与Celite（SiO₂）Si-O-Si振动的重叠，以及可溶性有机化合物萃取后不溶性组分（纤维和Celite）的相对富集效应。

3.6 3D打印物体物理化学评估

生坯状态评估显示，立方体在静态储存期间发生渐进各向异性形变：高度从1.97 ± 0.06 cm持续下降，90 min时保留原始尺寸的91.58 ± 2.73%；宽度略有增加，长度保持恒定。烘烤后，体积收缩率呈递减层级：对照（48.62 ± 0.44%）> 100 ppm（45.87 ± 0.94%）> 1000 ppm（38.52 ± 0.53%）> 500 ppm（36.59 ± 0.54%）。500 ppm配方表现出最高形状保真度（63.4%）。收缩呈强各向异性，对照处理在横向平面（长和宽，约23.3%）的收缩大于垂直方向。TPA分析显示，生坯状态对照硬度最高，100 ppm显著降低硬度，500和1000 ppm为中间值；烘烤后500和1000 ppm配方达到最大硬度（0.924 ± 0.135 N和0.962 ± 0.192 N）及最大胶粘性和咀嚼性，内聚性接近1。颜色分析显示，生坯状态随提取物浓度增加，L、a、b参数渐进显著下降；烘烤后a参数完全失去统计显著性，b*参数在100 ppm时保留较高值。

3.7 样品热氧化稳定性

K232指数（共轭二烯初级标志物）不受配方、热处理或其交互作用的显著影响，表明氢过氧化物在烘烤期间未作为累积物种存留。次级氧化指标（K266、K270、K274）则受配方、热处理及交互作用的显著影响。500 ppm烘烤样品的K270值（0.276）与其生坯对应值（0.242）无显著差异；而对照（0.367）、100 ppm（0.518）和1000 ppm（0.512）在烘烤后均显著升高。总类胡萝卜素方面，对照烘烤后浓度下降约75%（29.09至21.70 μg eq. Ax/g oil）；100 ppm和1000 ppm配方维持100%类胡萝卜素保留率，500 ppm配方保留率约80%（其初始Ax含量较高，为45.56 μg eq. Ax/g oil）。颜色分析中，500 ppm配方在生坯和烘烤状态均表现出最优色度剖面，保留最高总类胡萝卜素、a和Chroma值；1000 ppm烘烤样品的a、b*和Chroma急剧下降。脂肪酸谱分析显示，对照和500 ppm配方的总PUFAs和n?3 PUFAs在烘烤过程中均无显著损失，EPA和DHA亦无显著损失。

四、讨论与结论

讨论部分指出，scCO₂萃取产率高于文献参考值（11.15%），归因于400 bar压力下超临界流体密度增大提升溶剂能力，以及Celite作为惰性加工助剂改善床层渗透性和固液接触。PLE动力学中低k1值表明加压溶剂促进快速"洗涤"现象和细胞破裂，最小化初始传质阻力。响应面优化中乙醇-温度负交互作用反映了萃取效率与选择性间的拮抗机制，高温高乙醇组合增加花青素降解或聚合风险。受限条件下提取物ORAC值近1.9倍于全局条件，与富含高效过氧自由基清除物种的组成一致。FTIR结果证实了初始脱脂效果，最终结构谱由不溶性组分主导。

生坯状态渐进形变归因于肌原纤维网络屈服应力不足以完全抵消上层流体静力荷载的重力蠕变现象。500 ppm剂量下结构坍塌的缓解表明热力学有利的蛋白质-多酚相互作用，可能通过酚类诱导肌原纤维蛋白部分展开，促进含巯基或氨基基团的共价和非共价交联；而1000 ppm剂量下结构性能下降符合蛋白结合位点饱和机制，过量酚类导致空间位阻和无序聚集。烘烤后高浓度配方的显著硬化归因于多酚氧化为醌类后与蛋白质亲核基团反应促进交联。

次级氧化指标表明500 ppm浓度实现最有效的自由基清除和氧化传播中断，其效力不遵循线性剂量-响应关系；1000 ppm可能促进自缔合、促氧化反应或与内源基质促进剂的拮抗氧化还原相互作用。类胡萝卜素保留作为色素-脂质系统稳定性的综合指标，500 ppm优化了保护类胡萝卜素免于热氧化所需的物理化学平衡。脂肪酸谱分析表明3D打印相关烘烤过程未对PUFA含量产生显著损失，这对保持产品营养和功能价值具有重要意义。

研究结论指出，采用序贯生物精炼方法可实现Calafate果渣的功能性组分回收。萃取产率本身并非充分的质量标准，PLE优化必须优先考虑选择性、热不稳定化合物保留和提取物最终功能性。当应用于富含PUFAs的3D打印三文鱼糊基质时，天然酚类提取物表现出剂量依赖的技术效应，在热处理（烘烤）过程中同时发挥抗氧化和结构稳定化作用，最小化体积收缩和结构变形，同时通过最低比消光系数（K266、K270、K274）和最高类胡萝卜素保留率提供对烘烤诱导氧化劣化的最强抵抗。尽管Calafate酚类提取物在热氧化条件下对脂质稳定性、类胡萝卜素保留、打印性和结构几何稳定性具有有益作用，仍需进一步研究内源抗氧化剂（生育酚、抗氧化酶等）及其与提取物多酚的相互作用，深入探究酚-蛋白-脂质相互作用的微观结构机制，并评估油炸、微波等其他热处理工艺及冷藏、冷冻等长期储存条件下的脂质稳定性。上述发现强化了农工业副产物利用与下一代功能性3D打印海产品设计之间的联系。