《Antioxidants》：Lichen-Derived Polysaccharide from Cladina rangiferina Alleviates UVB-Induced Skin Photoaging: Potential Role of the NRF2-Mediated Antioxidant Response
编辑推荐：
在前期研究中，研究人员从可食用地衣石蕊（Cladina rangiferina (L.) Nyl.）中分离得到一种水溶性杂多糖（CRWP-S），其表现出较强的自由基清除能力。然而，其对紫外线B（UVB）诱导的皮肤光老化的保护作用及潜在分子机制尚待充分阐明。本研
在前期研究中，研究人员从可食用地衣石蕊（Cladina rangiferina (L.) Nyl.）中分离得到一种水溶性杂多糖（CRWP-S），其表现出较强的自由基清除能力。然而，其对紫外线B（UVB）诱导的皮肤光老化的保护作用及潜在分子机制尚待充分阐明。本研究建立了UVB诱导的BALB/c小鼠光老化模型及HaCaT角质形成细胞衰老模型，以评价CRWP-S的光保护作用及机制。微针辅助局部给予CRWP-S可有效减轻UVB诱导的宏观光老化表型，同时减轻真皮胶原降解并在体内恢复NRF2表达。CRWP-S处理可增强HaCaT细胞活力，降低细胞内活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平，并恢复超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性。在机制上，CRWP-S抑制衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性并下调衰老标志物p53和p21的表达。此外，CRWP-S促进NRF2核转位并上调下游血红素加氧酶-1（HO-1），同时下调KEAP1表达。使用ML385对NRF2进行药理学抑制可大部分消除CRWP-S的ROS清除和细胞保护作用。综上所述，这些研究结果表明CRWP-S通过激活KEAP1–NRF2信号通路对抗UVB诱导的皮肤光老化，凸显其作为抗光老化配方功能性生物活性成分的强大潜力。
皮肤光老化是主要由慢性太阳紫外线（UV）暴露驱动的主要外源性皮肤衰老过程，临床表现为深皱纹、松弛、色素沉着和真皮弹性组织变性，严重者可进展为光化性角化病等癌前病变。皮肤作为主要生理屏障对紫外线辐射极为敏感，累积暴露占外源性衰老的80%。UVB虽在 terrestrial 紫外辐射中比例较小，但其高能光子对表皮细胞产生更严重的生物学扰动，因此对抗UVB诱导的损伤仍是维持皮肤健康和开发功能性药妆品的重要策略。UVB诱导光老化的分子发病机制主要涉及直接DNA损伤和由活性氧（ROS）过度积累驱动的间接氧化应激。为对抗ROS驱动的氧化损伤，细胞依赖内源性抗氧化防御系统，其中KEAP1–NRF2通路作为主调控因子。天然多糖因高生物相容性、低免疫原性和广泛药理活性而被广泛认为具有皮肤光保护作用。石蕊（Cladina rangiferina (L.) Nyl.）是一种具有显著环境极端耐受性和数百年传统药用历史的高山物种，多糖占其叶状体干重的50%以上。研究人员前期制备了含α-和β-异头构型的水溶性杂多糖组分CRWP-S，其因高密度活性羟基而有效清除ROS并恢复氧化应激细胞的内源性抗氧化酶活性，但其对UVB诱导皮肤光老化的治疗潜力及分子靶点尚未探索。因此，本研究采用体外（HaCaT细胞）和体内（BALB/c小鼠）模型研究CRWP-S的光保护作用，重点关注其对KEAP1-NRF2信号通路的调控。研究人员开展了以下研究：采用微针辅助经皮递送CRWP-S，建立UVB诱导的小鼠光老化模型（递增剂量1、1.5、2、4 MED，每周三次，共四周）和HaCaT细胞衰老模型（340 mJ·cm?2 UVB），通过宏观表型观察、皮肤水合检测、H&E染色、Masson三色染色、天狼星红染色、免疫荧光、CCK-8、Annexin V-FITC/PI双染、SA-β-gal染色、DCFH-DA探针、生化试剂盒、Western blot及ML385药理学抑制实验，系统评价CRWP-S的光保护效应及机制。研究得出：CRWP-S可减轻UVB诱导的宏观光老化表型、改善皮肤水合、抑制表皮增生、减轻真皮胶原降解并恢复体内NRF2表达；在细胞水平增强HaCaT活力、减少凋亡、降低ROS和MDA水平、恢复SOD和CAT活性、抑制SA-β-gal活性并下调p53和p21表达；机制上CRWP-S下调KEAP1、促进NRF2核转位并上调HO-1，而ML385抑制NRF2可大部分消除其ROS清除和细胞保护作用。研究表明CRWP-S通过激活KEAP1–NRF2信号通路对抗UVB诱导的皮肤光老化，凸显其作为抗光老化配方功能性生物活性成分的强大潜力。本研究的重要意义在于首次阐明地衣来源多糖CRWP-S的抗光老化作用及以KEAP1–NRF2为靶点的分子机制，为功能性光保护药妆品开发提供了天然候选物。主要关键技术方法包括：石蕊采自祁连山（青海省），经L. Mei教授鉴定（编号20120703），CRWP-S按既定方案制备（热水提取、乙醇沉淀、Sevag法脱蛋白、冻干）；雌性BALB/c小鼠（7周龄，23±2 g，长春亿斯实验动物技术有限公司，许可证号SCXK 2025-0001）随机分为对照组、UVB模型组、UVB+低剂量CRWP-S（0.05 mg/mL）组和UVB+高剂量CRWP-S（0.1 mg/mL）组（n=6），采用窄带UVB灯（YIXIAN，G15T8E，峰值313 nm）照射并以200 μm微针滚轮辅助经皮递送；HaCaT细胞培养于含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM中，以340 mJ·cm?2 UVB建立衰老模型；检测手段包括皮肤电容仪（Corneometer? CM 825）、H&E、Masson三色、天狼星红偏振光染色、免疫荧光、CCK-8、Annexin V-FITC/PI流式、SA-β-gal染色、DCFH-DA探针、SOD/CAT/MDA生化试剂盒、Western blot及NRF2抑制剂ML385（10 μM）干预。
研究结果如下：3.1 CRWP-S改善UVB诱导的小鼠皮肤光老化并提高皮肤水合。通过宏观观察、皮肤电容仪检测和H&E染色发现，UVB照射致小鼠背部皮肤出现皱纹、粗糙、干燥和脱屑，皮肤水合从65.48±6.24 a.u.降至48.88±4.06 a.u.，表皮厚度从28.24±4.63 μm增至57.97±7.84 μm，伴细胞排列紊乱和真皮胶原纤维断裂；微针辅助CRWP-S处理减轻上述改变，高剂量组皮肤水合恢复至59.85±3.98 a.u.，表皮厚度降至33.77±4.11 μm，接近对照组。3.2 CRWP-S减轻UVB诱导的真皮胶原降解和结构紊乱。通过Masson三色染色和天狼星红偏振光染色发现，UVB照射致胶原纤维断裂、排列紊乱，胶原容积分数（CVF）从63.33±2.71%降至32.84±1.03%；CRWP-S处理恢复胶原束形态和排列，CVF恢复至57.35±4.39%。3.3 CRWP-S调节UVB诱导光老化小鼠皮肤NRF2表达。通过免疫荧光染色发现，UVB照射致NRF2荧光强度显著降低，CRWP-S干预上调NRF2荧光强度并增加其与DAPI标记细胞核的重叠信号，主要见于表皮层，提示CRWP-S可在体内促进NRF2表达和活化。3.4 CRWP-S缓解UVB诱导的细胞活力下降和凋亡增加。通过CCK-8和Annexin V-FITC/PI双染流式检测发现，CRWP-S在25–400 μg/mL范围内无毒性，可显著挽救UVB诱导的HaCaT细胞毒性并呈剂量依赖性恢复细胞活力；UVB照射致总凋亡率从4.82±1.20%升至68.18±3.15%，CRWP-S处理呈剂量依赖性降低凋亡率。3.5 CRWP-S减轻HaCaT细胞UVB诱导的细胞衰老。通过SA-β-gal染色和Western blot发现，UVB照射致SA-β-gal阳性细胞显著积累并上调p53和p21蛋白表达，CRWP-S处理减少SA-β-gal阳性细胞比例并抑制p53和p21表达。3.6 CRWP-S减轻氧化应激并调控HaCaT细胞KEAP1/NRF2信号通路。通过DCFH-DA探针、Western blot、免疫荧光和生化检测发现，UVB照射致细胞内ROS升高约2.1倍、SOD和CAT活性显著下降、MDA水平显著升高，并致NRF2 compensatory 升高但HO-1表达显著抑制、KEAP1表达基本不变；CRWP-S处理显著降低ROS荧光强度，下调KEAP1并上调NRF2和HO-1蛋白表达，促进NRF2核转位，并逆转SOD、CAT活性和MDA水平的变化。3.7 NRF2药理学抑制部分消除CRWP-S的抗光老化作用。通过ML385（10 μM）共处理结合SA-β-gal染色、流式细胞术、Western blot和免疫荧光发现，ML385抑制NRF2致SA-β-gal阳性细胞比例升高至与UVB模型组相当，共处理显著增加衰老细胞比例，维持细胞内ROS高水平，下调NRF2和HO-1表达并致NRF2于细胞周边点状聚集、核内荧光减少，且CRWP-S未能显著促进HO-1表达和NRF2核积累，表明CRWP-S的抗氧化和光保护作用主要通过激活NRF2信号通路介导。
讨论部分总结：慢性紫外线辐射触发皮肤光老化，其结构退化基础是持续氧化应激、基因组损伤、炎症浸润和酶性细胞外基质（ECM）降解的复杂相互作用。CRWP-S局部应用的主要挑战是其高分子量（15–200 kDa）超过传统500道尔顿被动经皮渗透经验规则，研究人员利用微针介导的物理微通道绕过角质层屏障，将大分子直接递送至表皮层，200 μm针长选择性突破角质层而不穿透更深真皮层层或触发伤口修复信号，组织学证据未见明显组织破坏或炎症细胞浸润，且所有组均统一应用微针以最小化其潜在混杂效应。本研究成功建立UVB诱导小鼠光老化模型，忠实再现严重皱纹和表皮干燥等临床光老化表型，递增至4 MED的方案旨在模拟累积UVB暴露并逐步达到诱导光老化所需累积剂量，同时避免高剂量急性皮肤损伤；仅采用雌性小鼠以确保内分泌背景均一，因雌激素缺乏已知可显著加重UVB触发的皮肤光老化。模型中表皮增厚反映角质形成细胞对UVB损伤的高增殖反应，该过程损害屏障功能并加速脱水；尽管UVB不完全穿透真皮，受损角质形成细胞释放的促炎细胞因子和基质金属蛋白酶（MMPs）可通过旁分泌信号传播至真皮，加速ECM降解和胶原断裂，组织病理学数据证实微针辅助CRWP-S干预有效减轻这些病理改变。细胞水平上，研究人员采用HaCaT细胞探究CRWP-S作用的机制基础，因角质形成细胞吸收约90%入射UVB能量；需注意HaCaT细胞单次高剂量UVB暴露主要模拟细胞应激诱导的早熟性衰老。从构效关系看，CRWP-S高密度羟基使其可作为氢或电子供体直接淬灭活性物种，这与铁皮石斛多糖（DOPs）等其他生物活性多糖一致，特定糖苷键和单体组成是自由基清除能力的关键决定因素；与研究人员前期在Pb2?损伤A549细胞中的发现一致，CRWP-S在本研究中也显著恢复UVB抑制的HaCaT细胞SOD和CAT活性，提示CRWP-S不仅通过直接清除自由基、还通过保护内源性抗氧化酶系统对抗氧化应激。UVB照射诱导的细胞内ROS过度生成是细胞衰老和死亡的主要原因。基础生理条件下，KEAP1通过其Kelch结构域结合NRF2并促进其降解，使胞质中NRF2表达维持低水平；尽管UVB照射作为内源性反应部分激活KEAP1-NRF2通路，但严重氧化应激压垮细胞清除能力。靶向激活KEAP1-NRF2信号已成为氧化应激相关疾病和年龄相关系统性疾病的首要策略，某些小分子和天然产物通过不同方式调控该信号轴：BZBS（八子补肾胶囊）直接与NRF2竞争KEAP1结合位点（Arg483，KEAP1精氨酸483残基）而不破坏KEAP1，从而释放NRF2入核并增加下游抗氧化酶表达；其他活性成分如桦木酸和Atonp2（源自隆肛蛙皮肤的非杀菌性cathelicidin成熟肽）诱导KEAP1泛素化和降解，导致NRF2释放和核转位。本研究中，持续UVB照射最终耗竭小鼠皮肤NRF2表达，尽管仍可检测到少量核NRF2积累，提示皮肤内源性抗氧化系统不足以应对持续氧化损伤；体外实验中，急性UVB暴露启动代偿性防御反应，NRF2蛋白上调但主要滞留于胞质，未能有效启动下游抗氧化酶表达；CRWP-S干预在体内有效恢复NRF2表达并促进其核积累，机制上体外研究揭示CRWP-S下调KEAP1蛋白表达、驱动NRF2核转位并随后上调下游HO-1表达，从而强化内源性抗氧化防御系统；关键的是，ML385药理学抑制NRF2可抑制CRWP-S的ROS清除能力并增加衰老细胞比例，这些发现提供有力证据表明CRWP-S的光保护和抗衰老功效部分由激活KEAP1/NRF2信号通路介导。此外，本研究存在一定局限性：与人类皮肤相比，脱毛小鼠皮肤毛囊密度更高，可能导致局部吸收被高估，因此将这些临床前发现（体外和动物模型）转化为实际人皮肤生物利用度仍存在差距；未来研究将聚焦评价人皮肤渗透性、长期安全性和配方优化，并将纳入遗传学方法（如siRNA敲低）进一步拓展本研究的机制见解；尽管如此，这些发现凸显CRWP-S作为功能性光保护药妆品的有前景的天然候选物。研究结论部分翻译：本研究系统证明CRWP-S对抗UVB诱导皮肤损伤的光保护作用及潜在分子机制。通过体内和体外模型，研究结果证实微针辅助递送有效克服CRWP-S大分子性质所致的经皮渗透限制，该策略有效减轻皱纹和皮肤脱水等UVB诱导光老化表型，并通过抑制表皮增生和真皮胶原降解维护皮肤结构完整性。机制上，CRWP-S调控衰老相关蛋白表达并同时强化抗氧化防御，通过这些通路维持角质形成细胞活力并减轻UVB暴露下的应激诱导早熟性衰老。这些发现表明，CRWP-S作为地衣来源多糖，启动内源性保护程序而非仅作为被动自由基清除剂，使其成为抗光老化应用的有前景的药剂。
