一种用于儿童口腔黏膜炎局部治疗的双药温敏黏附水凝胶的研制与表征

《Gels》：Development and Characterization of a Dual-Drug Thermosensitive Mucoadhesive Hydrogel for the Local Treatment of Pediatric Oral Mucositis

　　

严重口腔黏膜炎需要局部治疗以缓解疼痛、限制微生物增殖并支持黏膜修复，同时尽量减少对潜在有害辅料的暴露，尤其在儿童患者中。本研究旨在开发共载利多卡因盐酸盐（2% w/v）和氯己定二葡萄糖酸盐（0.2% w/v）的温敏黏附凝胶，用于局部颊部治疗。将Poloxamer 407与透明质酸钠盐、黄原胶、Carbopol 934或羟丙基甲基纤维素（HPMC）结合。比较仅含利多卡因或含两种药物的配方，以评估加入氯己定的影响。基于pH和凝胶化性质进行初步筛选后，对所选配方进行技术学、黏膜黏附、生物药剂学、稳定性和抗菌性能表征。Poloxamer 407浓度是决定凝胶性能的主要因素，而黏膜黏附聚合物主要影响特定技术学属性。氯己定加入未损害整体凝胶性能，保留了抗菌活性。凝胶表现出适宜的凝胶化、铺展性、黏膜黏附、滞留时间和释放性能，膜渗透可忽略。含20% Poloxamer 407和0.50% HPMC的双药配方成为最有前景的配方，兼具适当的机械性能、药物释放、抗菌功效和储存稳定性。总体而言，这些发现支持双药温敏黏附凝胶作为严重口腔黏膜炎局部管理（尤其在儿科中）的可行策略。

研究背景方面，儿童肿瘤患者接受化疗和放疗是治愈肿瘤的主要手段，但会引发严重口腔黏膜炎（SOM）。SOM是一种与黏膜保护屏障损伤相关的炎症性疾病，临床可从黏膜红斑发展至疼痛性溃疡，可能导致营养不良、继发性细菌、病毒或真菌感染，并因住院时间延长而增加医疗费用。SOM严重程度通常采用世界卫生组织（WHO）口腔黏膜炎分级量表评估，分为0至4级。SOM发生率受肿瘤类型、化疗和/或放疗方案及给药剂量等因素影响，血液恶性肿瘤和头颈部肿瘤患者风险更高。口腔黏膜对化疗诱导损伤高度敏感，导致黏膜上皮萎缩、变薄和溃疡，细菌和病毒感染（主要由金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和单纯疱疹病毒引起），口干以及进食、饮水或吞咽困难或严重不能。黏膜屏障破坏与化疗诱导的免疫抑制共同显著增加继发性微生物感染易感性并进一步加剧组织损伤。尤其在儿童患者中，SOM可导致显著残疾，使口服营养几乎不可能（需鼻胃管喂养），复杂化强效镇痛药给药，延长住院时间并增加医疗费用，最重要的是严重损害患者生活质量。此外，SOM可能导致肿瘤治疗暂时或长期中断，潜在损害治疗疗效并降低肿瘤成功根除的可能性。儿童和青少年因儿科恶性肿瘤高增殖率而尤其易感化疗诱导的SOM，约40%接受化疗方案的患者出现口腔副作用，而在12岁以下儿童中该数字高达90%。尽管是重大临床挑战，SOM至今仍研究不足，尚无 established 金标准用于预防和准确管理。尤其在儿科层面，严重黏膜炎患者的治疗方案仅限于适当口腔卫生和使用基于麻醉剂和/或抑菌/抗炎剂的漱口水控制病变相关疼痛。6岁以下儿童管理尤其困难，因难以进行口腔冲洗，常需用软布将漱口水溶液施用于黏膜，使治疗更加无效。此外，这些传统制剂在口腔中滞留时间非常有限，被唾液流和清除快速移除，导致作用持续时间短和需要频繁给药。当前治疗方法的局限性凸显需要替代局部药物递送系统以提高治疗疗效和患者依从性。其中，温敏黏膜黏附原位凝胶代表一种特别有前景的策略用于SOM和其他口腔疾病的局部管理。原位凝胶提供高度通用的制剂，具有大应用表面积，允许快速药物释放和延长接触，凭借其通过黏膜黏附与口腔黏膜建立延长接触的能力，同时形成一种保护屏障，实现持续局部药物释放。此外，温敏系统通过使制剂以液体形式应用便于给药，从而容易到达口腔甚至远程或隐藏部位，并在应用部位快速凝胶化，从而提高在受损黏膜上的滞留。这些性质使设计用于局部颊部递送的温敏黏膜黏附水凝胶在患者依从性和舒适性（无不适口感受）、更容易应用以及完全适应口腔黏膜不规则/受损表面方面优于黏膜黏附片剂或薄膜，无意外吞咽或排出风险。黏膜黏附片剂或薄膜的进一步缺点是其固定尺寸，导致在儿科患者中难以根据患者体重适当调整给药剂量。微米和纳米药物递送系统，包括脂质体、纳米纤维和聚合物纳米颗粒，最近也被研究作为改善SOM治疗的创新方法。然而，尽管其新兴潜力，其更复杂和昂贵的制备方法、大规模生产和重现性挑战和/或有限稳定性目前强烈限制其在实际临床实践中的适用性。尽管对温敏和黏膜黏附水凝胶用于口腔药物递送的兴趣日益增长，但仅有有限数量的制剂专门设计用于SOM局部管理，且没有专门针对儿科患者的。基于这些考虑，本工作的主要目标是开发和表征一种新型温敏黏膜黏附凝胶用于儿科患者SOM局部管理。该制剂设计为提供局部疼痛缓解、帮助预防口腔微生物感染并促进受损口腔黏膜再生。作为本研究的特色，特别努力开发无额外稳定剂和其他非必需辅料的制剂，从而尽量减少儿科患者对潜在有害物质的暴露。另一个考虑的重要方面是特别注意设计简单且可重现的制备方法，以促进未来医院药房临时配制和快速向住院患者发放制剂，也提高其依从性。温敏凝胶使用Poloxamer 407作为温敏聚合物，与不同黏膜黏附聚合物包括透明质酸钠、黄原胶、Carbopol 934和HPMC结合配制。通过共载利多卡因盐酸盐（2% w/v）和氯己定二葡萄糖酸盐（0.2% w/v）获得新型双作用制剂，分别提供局部镇痛活性和抗菌活性。之前已研究了一些用于颊部应用的不同种类黏膜黏附水凝胶，载有利多卡因或氯己定，如下表1总结。然而，这些制剂均未专门设计用于口腔黏膜炎治疗。此外，据研究人员所知，之前没有研究调查这两种药物同时用于任何类型颊部剂型开发，包括原位水凝胶，用于口腔黏膜疾病治疗，特别是儿科SOM。此外，尽管氯己定已广泛用于口腔制剂，但其对温敏黏膜黏附凝胶理化和技术性能的影响受到非常有限关注。因此，为研究氯己定对配方性能的影响，将仅含利多卡因的凝胶与含利多卡因和氯己定的凝胶进行比较。基于pH、凝胶化温度和凝胶化时间初步选择后，最有前景的配方在铺展性、注射性、黏膜黏附、变形性、滞留时间、水合和侵蚀性能、体外药物释放、膜渗透、稳定性和对金黄色葡萄球菌的抗菌活性方面进行全面表征。

研究人员开展的研究方面，2.1预制剂研究凝胶化温度和时间：温敏黏膜黏附凝胶使用增加浓度的温敏聚合物P407（15–20–25% w/v）与增加浓度的不同黏膜黏附聚合物（0.25和0.5% w/v）结合制备。温敏聚合物浓度范围基于初步研究选择，显示较高P407量（30% w/v）的配方在室温已凝胶化。黏膜黏附聚合物中，HA和黄原胶选为天然聚合物，而Carbopol?934和HPMC分别选为合成和半合成聚合物。每个二元系统的Tgel通过简单管倒置法在20–40 °C范围测定。对于显示理想Tgel（Tsol-gel ≥ 28 °C）的配方，在37 ± 0.5 °C记录tgel。含15% w/v P407的配方无论额外聚合物类型如何均未发生凝胶化，因此排除进一步研究，因其被认为不适合作为液体温敏制剂给药。含20%和25% P407、含不同浓度不同黏膜黏附聚合物的配方（未载药和载有单独LID或与CHX组合）的凝胶化性质总结于表2。该初步筛选使研究人员能够识别具有与预期应用兼容凝胶化性质并因此适合载药的配方。Tgel ≥ 28 °C和凝胶化时间短于1 min被认为对预期应用最佳。相反，室温已凝胶化或37 °C显示过长凝胶化时间的配方被排除。然而，显示凝胶化时间长达90 min的空配方也被选择用于后续载药，因初步观察表明药物加入促进凝胶化，导致凝胶化时间在目标范围内。这些配方因此纳入后续研究以评估LID和CHX加入对凝胶化温度和时间的影响。对于空配方，凝胶化温度和时间均受温敏聚合物浓度以及黏膜黏附聚合物类型和浓度强烈影响。一般来说，P407浓度从20%增加到25% w/v降低凝胶化温度，由于增强胶束堆积和聚合物链间更强相互作用。在黄原胶基配方中，含0.25% w/v黄原胶的系统显示凝胶化温度≥ 30 °C，导致37 °C相对长凝胶化时间（约2 min）。相反，黄原胶浓度增加到0.5% w/v导致配方在室温已凝胶化，无论P407浓度如何。这种行为可归因于较高黄原胶浓度下更高粘度和更密集聚合物网络形成，强烈降低分子流动性并促进更低温度下凝胶形成。对于Carbopol? 934基配方观察到类似行为，由于其高溶胀能力和较高浓度下显著增粘性质。HPMC效果强烈依赖于poloxamer浓度和整体聚合物网络密度。在含20% w/v P407配方中，HPMC浓度从0.25%增加到0.5% w/v导致凝胶化温度适度增加，对凝胶化时间仅有轻微影响。相反，在含25% w/v P407配方中，加入0.5% w/v HPMC促进室温已凝胶形成，表明在较高poloxamer浓度下聚合物缠结和胶束相互作用的联合效应足以诱导过早凝胶化。在所研究聚合物中，HA显示凝胶化温度和凝胶化时间之间最有利平衡，特别是在0.25% w/v、20% P407存在下，提供适宜凝胶化温度（29–30 °C）和最短凝胶化时间（55 s），同时避免室温过早凝胶形成。所有空配方在室温液态测量时显示接近中性pH（7.0–7.5）。基于此初步筛选，仅选择含HA和HPMC的选定配方用于载药。然后研究药物加入对凝胶化行为的影响。凝胶中LID存在导致凝胶化温度和时间显著降低。这种行为可归因于该药物的两亲性质，可能促进胶束堆积和增强聚合物链脱水，促进更低温度下溶胶-凝胶转变。随后加入CHX产生凝胶化温度和时间轻微增加。这种行为可归因于CHX高度亲水和阳离子性质，倾向于分配到水相，改变水与poloxamer之间相互作用，可能通过阻碍聚集和堆积，需要更高温度实现凝胶网络形成。然而，所有选定配方满足颊部给药预定义接受标准。LID加入轻微降低pH至约6.0值，而随后加入CHX未进一步修改pH，保持在同一范围并被认为适合颊部应用。基于这些结果，含20% w/v P407与0.25% w/v HA、0.25% w/v或0.5% w/v HPMC的配方以及含25% w/v P407与0.25% w/v HA的配方被选择进一步表征。

2.2选定配方的表征铺展性和黏膜黏附均有助于颊部凝胶给药期间和施用部位滞留期间性能，因此其测定对其适当表征非常重要。两项测试结果呈现于表3。进行铺展性分析以评估温敏凝胶应用于口腔黏膜的容易性。结果以硬度、剪切功和粘性表示。较低硬度和剪切功值通常与改善铺展性相关，从而更容易应用，这是疼痛性口腔黏膜病变局部给药的理想特征。LID存在导致凝胶铺展性一些改善，如剪切功和特别是硬度值降低所示，特别是在含25% w/v P407和0.25% w/v HA配方中。与相应LID载药配方相比，LID/CHX载药配方显示铺展性相关参数类似结果，表明抗菌剂加入未实质改变凝胶应用性质。唯一例外是含25% w/v P407和0.25% w/v HA配方，其中LID和CHX联合加入增加硬度、剪切功和粘性绝对大小，表明形成更结构化聚合物网络。为进一步了解并确定是否源于两种药物联合存在或可归因于单独CHX，也制备和评估含CHX作为唯一活性成分的相应配方。研究显示含单独CHX配方显示与相应未载药凝胶类似质地性质，表明效应可能源于两种药物与特定P407和HA浓度比组合。总体而言，这些发现表明铺展性主要由配方聚合物组成支配。从实践角度，这种有限效应有利，因为抗菌剂可包括而不损害凝胶应用于疼痛性口腔病变的容易性。尽管容易应用是重要前提，有效颊部配方还必须建立足够黏膜表面粘附以确保延长原位滞留。然后以粘附性、粘附功和脱粘距离评估黏膜黏附。粘附性反映从黏膜表面分离配方所需最大力，而粘附功代表分离所需总能量。脱粘距离反映配方在完全从黏膜模拟膜分离前可拉伸程度。LID以及LID/CHX组合加入对大多数温敏凝胶黏膜黏附性质仅有有限影响，表明药物存在未不利影响凝胶对黏膜表面粘附。仅含20% P407和0.25% HA配方中LID和CHX同时加入显示比相应单药载药配方显著更高粘附性和更大脱粘距离。研究显示含单独CHX配方显示与相应未载药凝胶可比质地性质，表明效应可归因于两种药物与P407和HA特定组合。总体而言，结果表明CHX存在对黏膜黏附影响取决于配方聚合物组成。重要的是，CHX加入未损害凝胶黏膜黏附性能，在HA基配方中甚至改善其粘附行为。药物加入对注射性仅有最小影响。特别是，与相应LID载药配方相比，CHX加入未显著修改静摩擦力（1.5–3.1 N）或平台力（<1.6 N），表明所开发凝胶间可比挤出行为。这些发现表明CHX存在未不利影响凝胶化前配方挤出行为。所开发凝胶可容易分配，允许在原位凝胶化前准确放置配方到目标病变。温敏凝胶变形行为在静态和动态条件下评估，后者进行以模拟凝胶应用后舌运动产生机械应力。静态变形测试对所有选定配方进行，而舌辅助变形测试仅对LID和LID/CHX载药凝胶进行，代表最终治疗配方。为测试条件间直接比较，仅通过两种方法评估的配方报告于表4。在静态条件下，所有配方在37 °C凝胶化后显示高尺寸稳定性。大多数凝胶保留原始形状，显示从初始沉积区域无测量位移，而仅配方P20-HPMC025-L和P20-HPMC025-LC显示轻微变形（1.5 mm）。这些发现表明快速形成足够稳定凝胶网络能够维持配方在静态条件下沉积部位。相反，所有在舌辅助条件下测试配方显示实质更大变形，值范围7.0至12.3 mm。这些结果表明舌运动产生机械应力在应用后凝胶变形和位移中起主要作用。这种机械作用可能减少应用部位保留配方量并潜在缩短其局部滞留时间。因此，舌辅助变形测试提供比常规静态评估单独更生理相关给药后凝胶行为评估。这方面在儿科应用中可能特别相关，舌运动可能增加被视为异物配方位移，潜在影响其局部滞留。然而，这种效应在严重口腔黏膜炎中可能不那么明显，其中疼痛和溃疡可显著限制舌活动性。此外，滞留时间临床相关性在儿科口腔黏膜炎背景下值得特别考虑，其中剧烈疼痛、减少口服摄入、脱水、营养状态受损和生活质量降低使有效局部治疗特别重要。然而，据研究人员所知，没有临床验证最小或最佳滞留时间已建立用于此状况温敏配方。延长滞留可增加配方与受影响黏膜接触持续时间，维持局部药物可用性，并潜在减少频繁再应用需要。原位滞留时间研究显示模拟口腔条件下配方依赖性滞留时间（图1）。P20-HPMC025-L和P20-HPMC050-L显示凝胶直径逐渐减小，表明凝胶基质逐渐侵蚀。相反，P25-HA025-L显示整个实验更好保留其初始结构，尽管其尺寸逐渐减小，表明测试条件下更大抗侵蚀性。相应LID/CHX（LC）载药配方也显示不同行为。配方P20-HPMC025-LC和P20-HPMC050-LC在120 min后仍清晰可检测，确保LID和CHX暴露在溃疡部位足够接触时间。相反，P25-HA025-LC经历更广泛侵蚀并在测试结束时几乎完全移除。因此，CHX加入未产生滞留行为均匀效应，似乎取决于每个配方整体聚合物组成。总体而言，所有凝胶显示滞留时间不少于一小时，同时在其侵蚀曲线不同。水合和侵蚀研究仅限于含20% P407配方，以评估黏膜黏附聚合物和LID和CHX加入影响同时维持恒定温敏聚合物浓度。这种方法减少P407浓度变化潜在混杂影响并允许选定配方间更直接比较。水合测试表明所有系统促进黏蛋白-琼脂凝胶适度水合，%水合值范围2.24至3.83%（图2）。含CHX配方显示比相应LID载药凝胶略高水合值。然而，差异适度，表明CHX加入对所开发系统水合行为仅有有限影响。总体而言，所有配方维持可比水合曲线，表明其在凝胶-黏膜界面提供适度水合环境能力，这可能有助于口腔黏膜病变治疗期间患者舒适。在含20% P407配方中，侵蚀研究显示所有配方逐渐重量损失，在模拟唾液条件下120 min后达到约8–14%，表明凝胶基质逐渐侵蚀（见图3）。这些发现表明基质侵蚀可能有助于药物释放，尽管需要释放研究以建立基质侵蚀和扩散对整体释放机制相对贡献。释放研究强调LID释放受配方组成强烈影响，而CHX显示更慢和更有限释放曲线（图4）。CHX存在未显著影响20% P407配方中LID释放，无论所用黏膜黏附聚合物如何。相反，在25% P407配方中，CHX加入导致LID释放显著降低。这一发现表明CHX可能修改药物-基质相互作用或胶束组织，从而降低LID在凝胶内流动性。事实上这种效应在25% w/v P407形成更密集堆积胶束网络中更明显。HPMC浓度从0.25%增加到0.5% w/v产生LID释放有限增加，无论CHX存在与否，表明在研究范围内，HPMC浓度对释放行为仅有次要贡献。相反，黏膜黏附聚合物类型影响双载药系统中药物释放。含HA配方显示比相应HPMC基凝胶略低LID释放。这些差异可归因于黏膜黏附聚合物物理化学性质和网络组织差异。HPMC是非离子纤维素衍生物，而透明质酸钠是阴离子多糖，其羧酸基团可与阳离子药物静电相互作用，潜在影响其流动性并促进药物在聚合物基质内滞留。黏膜黏附聚合物作用也应与P407结合考虑，其提供温敏凝胶化机制。因此，观察性能可能源于聚合物组成、凝胶结构和药物-基质相互作用联合效应，而非反映HPMC在所有配方中内在优越性。总体而言，P407浓度从20%增加到25% w/v降低LID释放，这种效应在CHX存在下更明显。这些发现进一步支持温敏聚合物在控制药物通过凝胶网络扩散中作用。CHX释放显著低于LID，120 min后仅达到约12%，与其在聚合物基质内更强滞留一致。LID释放曲线实验数据根据不同动力学模型（Korsmeyer-Peppas、零级、一级、Higuchi和Hixson–Crowell）拟合以获得其从水凝胶配方释放机制见解。结果以相关系数（R2）值报告于表5，作为拟合优度指数。Korsmeyer-Peppas释放指数n值，指示释放机制，也呈现。Korsmeyer–Peppas模型为所有检查配方药物释放曲线提供最佳拟合，如最高R2值所示，尽管一级和Higuchi拟合对几个配方给出相当类似R2值。CHX加入未观察到结果差异。Korsmeyer–Peppas扩散指数在各种配方范围0.41至0.49，在所有情况下指示Fickian扩散机制（n < 0.5）。然而，含HPMC水凝胶观察到更高n值似乎表明此类配方朝向异常传输趋势，其中聚合物溶胀也起作用。与含HA水凝胶相比这种不同行为可由含HPMC配方显示更高水合能力解释。这些值与扩散对药物释放重要贡献广泛一致，尽管指数单独不允许释放机制 definitive 分配。渗透研究表明所有配方中LID和CHX跨人工膜渗透可忽略。然而必须考虑，该测定仅提供药物渗透初步评估。事实上，所用人工亲脂膜模型，先前通过实验设计方法开发，实际上已证明在完整黏膜情况下对药物颊部吸收一些预测能力，然后用于初始快速筛选和评估。然而，在炎症/受损黏膜情况下，如本研究目标，需要进一步研究以使用更生理相关模型更可靠评估药物渗透，如离体颊部黏膜、重建口腔上皮或炎症黏膜模型。基于整体物理化学、机械和黏膜黏附性质以及药物释放结果，为每种黏膜黏附聚合物选择一个代表性配方。由于已证明CHX加入未不利影响所开发凝胶整体性能，同时提供额外抗菌效应，仅双载药配方被认为进一步研究。在HPMC基凝胶中，配方P20-HPMC050-LC被选择，因其提供最平衡整体性能，特别是在药物释放曲线方面，而配方P20-HA025-LC在HA基配方中被选择，由于其优越机械性能，同时在其余表征测试中显示满意性能。然后使用琼脂扩散测定评估两种选定配方抗菌活性。如表6可观察，两种配方（P20-HPMC050-LC和P20-HA025-LC）在24 h后产生宽抑制区，确认CHX在加入温敏黏膜黏附凝胶后保留其抗菌活性。两种配方观察到可比抑制区，表明黏膜黏附聚合物类型未不利影响CHX抗菌功效。最后，在储存1和2个月后评估选定配方稳定性（见表7）。配方P20-HPMC050-LC在整个研究期间维持其物理化学特征，pH、凝胶化温度或凝胶化时间无显著变化，显示良好稳定性。相反，配方P20-HA025-LC显示有限长期稳定性，2个月后出现可见沉淀物，表明储存期间物理稳定性损失尽管测量物理化学参数无显著变化。这些发现识别配方P20-HPMC050-LC作为进一步药物开发最有前景候选。

3.结论温敏黏膜黏附凝胶共载LID和CHX成功开发用于局部颊部药物递送。获得结果表明P407浓度是决定凝胶性能主要因素，而黏膜黏附聚合物类型和浓度主要影响特定技术性能。重要的是，CHX加入未损害所开发凝胶整体技术性能，保留其物理化学、机械、黏膜黏附、水合和原位滞留特征同时维持抗菌功效。其对LID释放影响仅限于含25% P407配方，其中更密集凝胶网络进一步限制药物扩散。所开发凝胶显示适宜凝胶化特征、铺展性、黏膜黏附、原位滞留时间和局部滞留，连同跨亲脂人工膜药物渗透可忽略，支持其用于局部颊部治疗适宜性。此外，舌辅助变形测试提供比常规静态测试更生理相关凝胶行为评估，强调给药后舌运动对配方位移影响。这种方法可能代表颊部半固体制剂表征有用补充工具。在所研究系统中，配方P20-HPMC050-LC成为最有前景候选，兼具适当机械性能、控制药物释放、保留抗菌功效和储存期间良好物理化学稳定性。总体而言，这些发现证明LID和CHX同时加入温敏黏膜黏附凝胶代表疼痛性口腔病变局部管理可行策略。