《Gels》：Study on Regulatory Mechanism of Carvacrol on Low-Temperature Adaptation of Listeria monocytogenes in Meat Gels and the Role of Histidine Kinase LisK
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单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）的低温适应性使其成为冷藏食品的主要污染源。本研究以组氨酸激酶LisK为靶点，探讨了LM在低温条件下的生长能力及适应机制，并选择香芹酚（carvacrol）与LisK相互作用以破坏LM的低
单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）的低温适应性使其成为冷藏食品的主要污染源。本研究以组氨酸激酶LisK为靶点，探讨了LM在低温条件下的生长能力及适应机制，并选择香芹酚（carvacrol）与LisK相互作用以破坏LM的低温适应性。基因表达的改变和膜磷脂的调整使LM能够在低温条件下稳健生长。LisK基因敲除验证了其在LM低温适应中的关键作用，支持LisK作为香芹酚的潜在作用靶点。香芹酚可通过多种相互作用力与组氨酸激酶LisK形成稳定结构。转录组学分析（transcriptomics）鉴定出香芹酚处理后LM在低温下存在747个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），其中双组分系统（two-component system）通路显著富集。香芹酚影响了LM在低温条件下的生长能力。此外，香芹酚处理后，LM在低温下的形态、膜通透性及胞内大分子均受到损伤。最后，香芹酚抑制了4 °C贮藏猪肉凝胶中LM的生长并保持了其质构特性。综上所述，上述结果证实了香芹酚对低温条件下LM生长的抑制作用。
论文解读
一、研究背景与意义
单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一种重要的食源性致病菌，其最突出的特征在于具有跨温度范围的生长能力，可在?1.5 °C至45 °C范围内生长，甚至能在?18 °C至?80 °C的极端低温下存活。冷藏是食品工业中抑制大多数食源性病原菌生长的常用物理屏障手段，但LM的低温适应性使其成为冷藏食品安全的重大威胁。已有研究表明，LM在4 °C贮藏的芒果、甜瓜和木瓜上的菌群数量可从1–4 CFU/样品增至0.8、2和2 log CFU/g，充分说明了其在冷藏温度下的增殖能力。因此，深入探究LM的低温适应机制，并开发有效的抑制策略，对于保障冷藏食品安全具有重要意义。
在LM的低温适应过程中，双组分信号转导系统（two-component signal transduction system）发挥着关键作用。该系统由组氨酸激酶（histidine kinase）和反应调节蛋白（response regulatory protein）组成。在部分LM菌株中，LisK（组氨酸激酶）/LisR（反应调节蛋白）双组分系统被证实负责LM的低温适应性。当受到冷刺激时，组氨酸激酶LisK发生自身磷酸化，随后将磷酸基团转移至反应调节蛋白LisR，进而引起下游基因转录和翻译水平的变化，驱动LM进行代谢调整以应对低温损伤。因此，LisK的自身磷酸化是LM感知和响应冷刺激的前提条件。在分子水平上揭示LisK与LM低温适应性之间的关系，并寻找抑制LisK活性的理想抑制剂，对于破坏LM的低温适应性和保障冷藏食品安全具有重要意义。
香芹酚（carvacrol）是一种天然单萜酚类化合物，具有多种生理活性，是多种植物精油的主要活性成分，被普遍认为是安全的食品添加剂。其分子结构同时含有疏水性芳香环和亲水性酚羟基，这一化学结构使其能够通过π–π共轭作用与LisK活性位点中的芳香族氨基酸残基相互作用，并通过氢键形成与LisK活性位点中氨基酸残基的极性基团相互作用。然而，香芹酚对LM低温生长能力的实际影响及其对LM低温适应性调控网络的研究此前尚未见报道。
二、研究概述
本研究以LM ATCC 19115为研究对象，系统探究了LM在低温条件下的生长能力和适应机制，确认了组氨酸激酶LisK在LM低温适应中的关键作用；随后研究了香芹酚与LM LisK之间的结合方式和结合能力；最后详细考察了香芹酚对LM在低温下生长能力、表型变化、生理活性及调控网络的影响，以及香芹酚在冷藏温度贮藏肉凝胶中对LM的抑制效果。
三、主要关键技术方法
研究人员采用了多种关键技术手段开展本研究。GC-MS（气相色谱-质谱联用）用于检测LM细胞膜磷脂中脂肪酸组成变化；RT-qPCR（实时荧光定量PCR）用于分析低温适应相关基因的表达水平变化；基因敲除与回补技术用于构建LisK基因缺失菌株（ΔLisK）及回补菌株（ΔLisK-C）以验证LisK的功能；分子对接（AutoDock软件）与分子动力学模拟（Gromacs软件）用于分析香芹酚与LisK的结合模式及结合稳定性；转录组学分析用于揭示香芹酚处理后LM在低温下的差异表达基因及富集通路；SEM（扫描电子显微镜）和TEM（透射电子显微镜）用于观察LM细胞形态变化；此外还采用了膜通透性测定、DNA含量测定、DAPI荧光染色、BCA蛋白定量及核酸含量测定等生化分析方法，以及肉凝胶微生物计数和质构分析（texture profile analysis，TPA）评价香芹酚在实际食品体系中的抑菌效果和质构保护作用。
四、研究结果
4.1 LM在低温下的生长行为
研究人员在不同温度（4 °C、15 °C、25 °C）下培养不同浓度（102、103、10? CFU/mL）的LM，通过测定OD???值绘制生长曲线。结果显示，LM在25 °C下生长迅速；在15 °C下生长延迟，滞后期延长；在4 °C下滞后期显著延长，但所有测试浓度下培养6天后OD???值均出现显著增加。较高浓度的LM在4 °C下表现出更强的适应能力，表现为更短的滞后期。上述结果表明LM具有强大的低温适应能力，即使在冷藏温度下经过代谢调整后仍能在对数生长期快速生长。
4.2 LM的低温适应机制
GC-MS检测结果显示，LM细胞膜磷脂中共检测到11种脂肪酸。37 °C培养的LM细胞膜中不饱和脂肪酸比例为38.99%，而4 °C培养的LM达到58.49%。不饱和脂肪酸具有较低的熔点，其独特结构抑制了分子间的稳定堆积，因此膜磷脂中较高比例的不饱和脂肪酸有利于维持膜流动性。RT-qPCR结果显示，与37 °C培养相比，4 °C培养的LM中* gbuA、gbuB和opuCA基因分别上调102%、254%和262%，这些基因编码甜菜碱转运蛋白，其上调使LM能够在低温下高效地从环境中转运甜菜碱进入细胞，维持渗透压平衡。此外，sigB、cspA和cspD*基因的相对表达量分别增加220%、12%和77%，其中SigB因子是LM的主要应激调节因子，CspA和CspD是LM的主要冷休克蛋白，这些基因的上调使LM能够适应并减轻冷刺激造成的损伤。
4.3 组氨酸激酶LisK在LM低温生长中的作用
研究人员通过同源重组技术构建了LisK基因缺失菌株ΔLisK，并进一步构建了回补菌株ΔLisK-C。生长曲线比较显示，在4 °C条件下，ΔLisK的生长能力显著弱于野生型LM，而ΔLisK-C的生长曲线与野生型LM相似，均显著高于ΔLisK；在37 °C条件下，三种菌株的生长能力无显著差异。这一结果证明LisK基因的缺失特异性地损害了LM在冷藏温度下的生长能力，而回补LisK基因则恢复了其低温生长能力，从而证实了LisK基因及其编码产物组氨酸激酶LisK在LM低温适应性中的关键作用。
4.4 香芹酚与LisK的相互作用
分子对接结果显示，香芹酚可通过氢键相互作用与LisK中的ASP A: 238稳定结合，结合能为?6.6 kcal/mol。分子动力学模拟表明，10 ns后氢键数量趋于稳定，香芹酚与LisK之间的总结合能为?16.47 kcal/mol，表明二者的结合是自发且热力学稳定的。残基分解能量分析显示，VAL、ILE和TYR氨基酸残基的能量值显著为负，表明这些残基对香芹酚与LisK相互作用的稳定性贡献显著。香芹酚与LisK的VAL、ILE和LEU疏水残基之间通过范德华力、烷基相互作用和π–烷基相互作用形成强疏水相互作用，此外香芹酚与LisK中的TYR之间还存在π–π堆积相互作用。RMSD和Rg分析表明，10 ns后RMSD值趋于稳定，Rg值降低并稳定在1.95–2.0 nm范围内，表明香芹酚结合后LisK结构变得更加紧凑稳定。自由能景观图显示存在显著的吉布斯自由能盆地，证实香芹酚与LisK复合物的构象是稳定的。
4.5 转录组学分析
转录组学分析显示，香芹酚处理组与对照组共有2887个基因共表达，香芹酚处理组有10个独有基因，对照组有12个独有基因。香芹酚处理后，LM共有747个基因的表达发生显著变化，其中555个基因显著上调，192个基因显著下调。GO功能富集分析显示，差异表达基因在生物学过程的细胞组分生物合成、细胞组分的膜以及分子功能的化合物结合中显著富集。KEGG通路富集分析显示，差异表达基因富集于291条通路，其中仅双组分系统通路（lmod02020）经多重检验校正后达到统计学显著富集水平（Padj = 0.0019，p < 0.05）。其他通路如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、ABC转运体、糖酵解/糖异生和群体感应虽含有较多差异表达基因，但未达到显著性阈值。这一结果与前述基因敲除和蛋白-配体相互作用证据一致，表明香芹酚的作用机制与LisK-LisR双组分系统通路密切相关。
4.6 香芹酚对LM低温生长的抑制作用及调控机制
生长曲线测定显示，在4 °C培养15天后，对照组OD???值从0.082增至0.440，而1/2 MIC、MIC和MBC浓度香芹酚处理组的OD???值分别仅从0.083增至0.398、0.084增至0.087和0.084增至0.093。MIC和MBC浓度处理下LM数量在15天内几乎不变，表明香芹酚在低温条件下对LM具有高度抑制活性。SEM和TEM观察显示，对照组LM呈椭圆形或短杆状，细胞表面光滑、结构完整；MIC浓度处理组LM细胞结构出现轻微收缩和损伤迹象；MBC浓度处理组LM表现出严重的形态损伤甚至破裂，细胞表面严重收缩凹陷，胞内物质泄漏。膜通透性测定显示，香芹酚处理后LM的OD???值在初始5小时内显著升高，表明细胞膜通透性增加；作用10小时后OD???值下降，表明细胞膜被严重破坏导致β-半乳糖苷酶活性受损。胞内DNA含量测定显示，对照组为627.9 μg/mL，而1/2 MIC、MIC、MBC和2MBC处理组分别降至508.83、337.48、278.77和211.16 μg/mL。DAPI荧光染色结果一致，香芹酚处理组荧光强度显著低于对照组且随浓度增加而降低。胞内蛋白含量从对照组的1.684 mg/mL降至2MBC处理组的1.405 mg/mL，胞内核酸吸光度从对照组的2.92降至2MBC处理组的1.037。上述结果表明香芹酚处理能够破坏LM在低温下的细胞结构和完整性，导致胞内DNA、蛋白质和核酸等大分子物质泄漏，从而全面影响LM在低温下的生长行为。
4.7 香芹酚对冷藏肉凝胶中LM的控制效果
在4 °C贮藏的猪肉凝胶中，对照组LM数量随时间逐渐增加，8天时达到6.76 log CFU/g；而MIC和MBC浓度香芹酚处理4天后，LM数量分别比对照组降低0.43和1.35 log CFU/g。结果表明香芹酚抑制了冷藏肉凝胶中LM的生长，显示了其作为冷藏食品防腐剂的潜力。
4.8 香芹酚对冷藏肉凝胶质构的影响
质构分析结果显示，所有组别的肉凝胶样品在10天贮藏后硬度、弹性和咀嚼性均显著下降，而内聚性和粘附性呈显著上升趋势。与对照组相比，MIC和MBC浓度香芹酚处理组的质构参数变化幅度较小，其中MBC浓度处理组的质构劣化程度最低。香芹酚处理显著减缓了粘附性的上升，进一步支持其缓解LM引起的腐败变质的能力。香芹酚在MIC和MBC浓度下未对肉凝胶的硬度、弹性和咀嚼性造成严重破坏，表明所用剂量的香芹酚未严重干扰肉凝胶基质中的蛋白质-蛋白质相互作用。
五、讨论与结论
研究人员指出，肉凝胶体系代表了一种简化的实验室模型，未来需要使用自然污染的肉基质进行进一步验证以支持实际防腐应用。此外，由于实验设计中未包含未接种的凝胶样品，无法完全区分冷藏老化、LM生长以及香芹酚与肉蛋白基质之间潜在直接相互作用所导致的质构变化。
研究结论表明，LM具有强大的低温适应能力，即使在4 °C冷藏温度下仍能在对数生长期快速生长。4 °C培养的LM细胞膜中不饱和脂肪酸含量（58.49%）远高于37 °C培养的LM（38.99%），且* gbuA、gbuB、opuCA、sigB、cspA和cspD等低温适应相关基因的表达均上调。野生型LM与ΔLisK-C的生长能力相似，均优于ΔLisK在4 °C下的生长；而三种菌株在37 °C下生长能力无显著差异，证实了LisK*基因及其产物组氨酸激酶LisK在LM低温适应性中的关键作用。香芹酚可通过氢键、疏水相互作用和π–π共轭作用与组氨酸激酶LisK自发形成热力学稳定的结构，但本研究缺乏香芹酚在生化水平上直接抑制LisK激酶活性的直接证据，因此LisK可能代表了介导香芹酚在LM中作用的候选靶点。香芹酚影响了LM中多个基因的转录，相应地影响了LM的相关生物学过程、细胞组分、分子功能和通路。香芹酚损害了LM在冷藏条件下的生长能力，改变了LM在低温下的形态、膜通透性、胞内核酸和胞内蛋白，从而全面影响LM在低温下的生长行为。最后，香芹酚能够抑制冷藏温度下肉凝胶中LM的生长，并在MIC和MBC浓度下减缓4 °C贮藏期间肉凝胶的质构劣化且未对凝胶蛋白网络造成严重破坏，表明其作为冷藏肉凝胶类食品生物防腐剂具有广阔的应用前景。
