《Cells》：Deciphering the Pathogenicity of the PMS2 p.His701Gln Variant in a Family with Elderly-Onset Extracolonic Lynch Syndrome
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PMS2错义变异在Lynch综合征（LS）中的解读仍然困难，尤其是在临床证据有限的情况下。研究人员对一个PMS2变异NM_000535.7: c.2103T>A; p.His701Gln（p.H701Q）进行了研究，该变异目前被归类为意义不明变异（VUS），是
PMS2错义变异在Lynch综合征（LS）中的解读仍然困难，尤其是在临床证据有限的情况下。研究人员对一个PMS2变异NM_000535.7: c.2103T>A; p.His701Gln（p.H701Q）进行了研究，该变异目前被归类为意义不明变异（VUS），是在一名71岁的小肠腺癌患者中发现的。为阐明其临床意义，研究人员结合了临床、计算机（in silico）和功能分析。计算预测一致指向有害效应，AlphaMissense赋予其高度损伤性评分，且大多数独立预测工具支持相同解读。H701Q影响PMS2高度保守的C端区域，邻近功能关键的Glu705残基。在HEK-293T细胞中，与野生型PMS2相比，PMS2-H701Q的蛋白水平显著降低，支持其对蛋白稳定性的影响。免疫共沉淀实验进一步显示PMS2-H701Q与MLH1之间的相互作用大幅减少，提示MutLα复合物形成受损。这两种效应均与致病性对照PMS2-E705K所观察到的效应相当。总体而言，计算与功能发现的一致性为H701Q的有害效应提供了有力证据，并强化了其临床解读。总之，这些发现证明了在ClinGen-InSiGHT PMS2特异性ACMG/AMP变异分类指南下功能证据的实用性，并支持将PMS2变异NM_000535.7: c.2103T>A; p.His701Gln（p.H701Q）从意义不明变异（VUS）重新分类为可能致病性。
研究背景：DNA错配修复（MMR）通路是进化上保守的复制后校对系统，负责纠正逃逸DNA聚合酶保真度的碱基错配及微插入/缺失错误，对维持真核基因组完整性至关重要。人类中该通路由MutS与MutL两个高度保守的异二聚体蛋白复合物介导，MutS识别碱基错配与插入缺失环（IDLs），MutL协调下游错配DNA链的降解、切除及再合成。Lynch综合征（LS）由MMR通路基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）的胚系致病变异或EPCAM结构缺失所致，与结直肠癌、子宫内膜癌及包括小肠、胃、尿路、卵巢和中枢神经系统肿瘤在内的结肠外恶性肿瘤风险显著升高相关。PMS2作为MutLα异二聚体的核酸内切酶亚基提供催化活性，MLH1主要作为结构支架。PMS2相关疾病的识别相对有限，部分源于该基因座存在高度相似的旁系同源序列（如假基因PMS2CL），使变异检测与解读困难。此外，PMS2致病变异杂合携带者外显率降低、发病年龄显著晚于其他MMR基因变异携带者，70岁时结直肠癌累积风险约15–20%，任何LS相关恶性肿瘤约25–32%，远低于MLH1或MSH2携带者的约70–80%。PMS2缺陷肿瘤常遵循传统腺瘤-癌序列，MMR功能丧失可能发生于肿瘤发展较晚阶段。小肠腺癌是LS罕见但临床重要的前哨恶性肿瘤，单等位基因LS携带者通常发病年龄较晚。LS临床管理的主要挑战仍是意义不明变异（VUS）的解读，错义变异可能产生全长蛋白而被免疫组化（IHC）检出，尤其PMS2 C端核酸内切酶结构域的变异可选择性损害链特异性切口引入而保留与MLH1的相互作用。本研究采用多学科方法，结合遗传、临床、体细胞、生物信息学与实验方法，评估所识别的PMS2错义变异对结构稳定性及LS相关临床表型的影响。先证者为71岁男性，诊断小肠腺癌并伴异时性乙状结肠腺癌性息肉，遗传分析发现PMS2罕见错义变异c.2103T>A; p.His701Gln（p.H701Q），分类为VUS，位于高度保守的C端催化区兼MLH1相互作用域。鉴于患者年龄与特定肿瘤部位，该病例体现了PMS2相关LS作为迟发型独立临床实体的新兴特征。研究人员通过分析该变异在家系中的共分离及其在MutLα复合物结构框架中的位置，评估其潜在致病性，强调对老年结肠外肿瘤患者扩大LS临床怀疑的重要性，并支持全球范围内PMS2 VUS重新分类以提高癌症监测准确性。研究结论：本病例凸显了在老年人中识别LS的临床相关性，以及当临床与分子发现提示时变异重新分类的重要性。基于ACMG/AMP标准并得到结构建模支持的PMS2 p.H701Q变异重新分类为可能致病性，强调了整合临床、遗传与计算机证据以优化变异解读并指导临床评估的价值。
主要关键技术方法：采用靶向下一代测序（NGS）多基因 panel 检测25个遗传性癌症相关基因，并以长片段PCR结合Sanger测序验证PMS2变异；对先证者福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织行微卫星不稳定性（MSI）检测、BRAF V600E检测及MLH1启动子甲基化分析（MS-MLPA）；行MLH1、MSH2、MSH6、PMS2免疫组化（IHC）；采用Align-GVGD及18种计算机预测工具（含AlphaMissense）进行meta分析；在HEK-293T细胞中瞬时转染野生型及突变型PMS2、MLH1质粒，行免疫印迹与免疫共沉淀；采用双侧单样本Student t检验进行统计。样本来源为意大利国家胃肠病学研究所IRCCS "Saverio de Bellis"医学遗传学单位咨询的先证者及其家系。
研究结果：
3.1 临床病史与遗传发现：报告一例71岁男性，异时性胃肠道肿瘤（乙状结肠腺癌性息肉与小肠腺癌，间隔5个月诊断）。家系两代评估未发现胃肠道和/或子宫内膜恶性肿瘤，反映PMS2相关LS特征性低外显率与迟发；因无法确定变异是否为新发，不能排除该可能。NGS发现PMS2 c.2103T>A; p.His701Gln，未见于ClinVar与InSiGHT数据库，依ClinGen-InSiGHT PMS2特异性ACMG/AMP指南分类为VUS（PS2 Supporting、PM2 Supporting、PP3 Supporting、PP4 Supporting），Sanger测序确认。鉴于临床表型与受累基因一致及变异位于PMS2-MLH1相互作用域，VUS分类似显局限，遂行进一步多层次分析。
3.2 先证者MMR蛋白表达：小肠腺癌与乙状结肠腺癌性息肉样本均显示高度微卫星不稳定性（MSI-H）。IHC显示两处病变均完全缺失PMS2核染色，而MLH1、MSH2、MSH6表达正常，MLH1核表达在两处病变中均保留。
3.3 生物信息学：人PMS2序列与不同分类群同源蛋白比较显示His701高度保守。AlphaMissense预测H701Q有害，致病性评分0.998，该区域AlphaFold预测置信度高（pLDDT值高）；His701邻近残基（698–709）致病性评分接近1，提示该区段对氨基酸替换强烈不耐受。18种计算工具meta分析中16/18预测为损伤性（共识二元评分0.889；88.9%）。
3.4 PMS2 H701Q损害PMS2稳定性与MutLα复合物形成：HEK-293T细胞（MLH1与PMS2均沉默）瞬时转染48小时。免疫印迹显示过表达PMS2 WT质粒显著稳定PMS2蛋白水平，而PMS2_H701Q质粒降低PMS2稳定性，与阳性对照PMS2_E705K相当；H701Q较WT蛋白丰度显著降低，部分条件下降低程度较E705K更明显；β-actin与GFP分别确认上样与转染效率可比。免疫共沉淀（抗MLH1抗体）显示PMS2 WT与MLH1明确结合，而PMS2-H701Q显著减少、在MLH1免疫沉淀物中几乎检测不到；PMS2-E705K亦显示类似受损结合，提示该变异在MutLα复合物形成中的功能缺陷；E705K对照此前尚未就其形成MutLα复合物的能力进行功能表征。上述结果表明H701Q大幅损害PMS2稳定性及其与MLH1的相互作用，为缺陷性MutLα复合物提供功能证据。
讨论部分总结：本研究结合计算机分析、细胞实验与患者来源材料调查，对PMS2 c.2103T>A; p.His701Gln变异进行表征，整合方法提供该变异有害效应的一致性证据，也说明PMS2错义变异解读的困难（该基因分析历史上受高度同源假基因困扰）。71岁小肠腺癌患者中识别该变异，其临床表现与PMS2相关衰减但临床相关的癌症易感性一致。实验数据提供多条功能相关性证据：计算机分析已指向有害效应，细胞实验显示PMS2-H701Q蛋白水平较WT明显降低，且至少与同一C端区域的致病性参考变异PMS2-E705K相当。H701Q位于PMS2 C端区域，该区域含MLH1相互作用域与latent核酸内切酶域，含对DNA切口及启动DNA纠正与再合成关键的金属结合基序（DQHAX2EX4E）；既往研究报道该基序中包括PMS2 H701Q在内的多个变异损害MMR活性。效应不限于蛋白丰度：免疫共沉淀显示PMS2-H701Q与MLH1结合明显减少，提示亦影响MutLα复合物形成；E705K显示类似受损相互作用，虽其作为催化失活变异已被广泛研究，但对PMS2–MLH1复合物形成的影响表征较少；这提示H701Q可损害PMS2蛋白稳定性从而减少参与MMR的PMS2量，并进一步表明H701Q影响PMS2第二项 essential 特性即形成含MLH1的MutLα复合物。使用E705K的研究显示该蛋白虽能结合DNA但不能产生MMR所需切口；由于残基701属同一关键结构，组氨酸变为谷氨酰胺即使不完全破坏蛋白稳定性，也可能影响催化位点准确性或其与PCNA的相互作用（后者对激活核酸内切酶活性必需），这与其他C端VUS如位于锌结合基序的p.Asp699His相似（尽管蛋白稳定表达仍损害MMR功能）。这些观察强调整合功能证据与临床和分子数据以改善PMS2变异解读、优化遗传咨询与临床管理的重要性。MLH1/MSH2携带者任何LS相关恶性肿瘤累积风险约70–80%，而PMS2携带者70岁时仅约25–32%；这种以71岁先证者为代表的迟发表型可能反映MutL复合物内的功能冗余：PMS2缺陷时其支架伙伴MLH1可能通过与MLH3或PMS1等替代伙伴配对部分保留MMR活性；因此PMS2携带者的肿瘤发生常绕过MLH1家系中观察到的侵袭性"dMMR隐窝"通路，而遵循更迁延的腺瘤-癌进展。此外，虽然结直肠癌与子宫内膜癌是主要表现，小肠腺癌仍是PMS2谱系中关键但较罕见的组成部分；在组成性错配修复缺陷（CMMRD）中小肠肿瘤通常出现于生命第二个十年，本研究表明在单等位基因携带者中这些结肠外肿瘤即使在七十多岁也可作为前哨恶性肿瘤，凸显对老年MSI-H结肠外肿瘤患者提高临床警惕的重要性。PMS2相关LS分子诊断的关键挑战是IHC的误导性：PMS2错义变异常产生保留抗原性的全长蛋白，导致尽管酶活性完全丧失肿瘤染色仍"完整"；近期研究显示由错义突变所致LS病例中高达44%出现意外MMR蛋白表达，而截短突变所致者仅11%，这种"意外反应性"现象若单用IHC可致假阴性筛查结果。本研究强调整合功能测定的必要性：对PMS2而言，临床数据（如共分离与家族史）常因低外显率而有限，功能测定对将变异从"不确定"转为"可能致病"至关重要。这些发现对PMS2变异的临床解读尤其相关：根据ACMG/AMP与ClinGen-InSiGHT框架，PS3标准旨在纳入显示变异对基因或蛋白功能异常效应的确证功能证据；本研究中两项独立实验读数表明PMS2-H701Q功能缺陷（蛋白稳定性降低与掺入含MLH1的MutLα复合物受损），以PMS2 WT与E705K变异作为实验对照进一步支持该解读，这些结果为H701Q有害效应提供功能证据并支持应用ACMG/AMP与ClinGen-InSiGHT PS3标准。总体而言，定量功能指标如完全体外MMR活性（CIMRA）测定与基于细胞的稳定性测定提供校准的致病性比值（OddsPath），可正式作为强功能证据（PS3）纳入PMS2的ACMG/AMP变异分类标准。根据ClinGen-InSiGHT PMS2特异性ACMG/AMP变异分类标准指南，PMS2胚系变异（NM_000535.7: c.2103T>A; p.His701Gln）可从VUS（PS2 Supporting、PM2 Supporting、PP3 Supporting、PP4 Supporting）重新分类为可能致病性（PS2 Supporting、PS3 Moderate、PM2 Supporting、PP3 Supporting、PP4 Supporting）。研究优势包括多层调查结合长片段PCR/NGS测序、详细家系共分离分析、全面的18工具计算机meta分析及评估蛋白稳定性与MutLα复合物形成的直接细胞功能测定，并以已确立的致病性对照PMS2-E705K作比较。局限性：作为单家系研究，临床共分离数据受PMS2胚系变异特征性低外显率与迟发年龄固有局限；功能数据显示严重蛋白失稳与MLH1结合破坏（支持ACMG/AMP PS3标准至中等水平），但未直接进行体外重构核酸酶测定；因此尽管一致性数据强烈支持在ClinGen-InSiGHT标准下将PMS2 p.His701Gln从VUS重新分类为"可能致病"（Class 4），最终定为Class 5致病性仍需额外人群水平病例对照研究。
