UFMylation系统：GPCR生物合成运输的新型调控机制与治疗靶点

《Cells》：Ufmylation System: Novel Control of GPCR Biosynthetic Trafficking and Therapeutic Targets

G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCRs）构成最大的膜受体家族，调节多种多样的细胞功能，并作为重要的治疗靶点。GPCR生物学中一个基本但尚未充分解决的问题是，单个受体在内质网（endoplasmic reticulum, ER）中合成后如何被高效递送至其功能目的地。UFM1化修饰（ufmylation）是一种类泛素化翻译后修饰，其中泛素折叠修饰因子1（ubiquitin-fold modifier 1, UFM1）被缀合至靶蛋白。与泛素化相比，UFM1化修饰的生理和病理意义尚不明确。然而，近期研究揭示了UFM1化修饰系统在维持ER稳态和引导GPCR从ER输出中的关键功能。在本综述中，研究人员简要总结了理解UFM1化修饰系统的最新进展，讨论了其在ER来源的COPII囊泡处新生GPCR的生物合成运输和分选中的作用，并探讨了靶向UFM1化修饰介导的GPCR运输的治疗潜力。

**1. UFMylation系统及其功能**
**1.1 UFMylation**
UFMylation是一种可逆的翻译后修饰，通过E1酶UBA5、E2酶UFC1和E3酶UFL1组成的三酶级联反应，将泛素折叠修饰因子1（UFM1）共价缀合至靶蛋白的赖氨酸残基。UFM1最初以无活性前体pro-UFM1形式合成，其C端两个氨基酸被UFM1特异性蛋白酶（UFSPs）切除，暴露Gly83形成成熟UFM1。随后，成熟UFM1被UBA5通过硫酯键激活，再转移到UFC1，最终由UFL1与接头蛋白UFBP1和CDK5RAP3组成的支架型E3复合物介导，转移至靶蛋白的赖氨酸残基。

**1.2 去UFMylation**
去UFMylation由两种UFM1特异性蛋白酶（UFSP1和UFSP2）完成。UFSP1主要定位于细胞质，负责pro-UFM1的成熟以及去除UFC1上Lys122处的UFM1修饰，从而解除其抑制作用。UFSP2主要定位于内质网（ER）膜，是从UFM1化蛋白上移除UFM1的主要蛋白酶，尤其针对ER相关底物如核糖体60S亚基成分RPL26。

**1.3 底物**
UFM1化修饰于2004年被发现，但2020年前仅鉴定出少数底物。ER膜蛋白UFBP1是首个被确定的UFM1底物，其修饰位点为人的Lys267（小鼠为Lys268）。UFBP1通过与UFL1相互作用组装E3复合物骨架，增强UFL1活性，因而是UFMylation系统的关键调控因子，不仅仅是底物。近六年研究扩展了底物谱，包括ER、胞质、线粒体、细胞核、纤毛及核糖体等不同区室蛋白。其中RPL26是主要底物，其Lys132和Lys134的修饰在ER-核糖体相关质量控制（ER-RQC）中发挥关键作用。

**1.4 UFMylation及其在ER处的细胞功能**
UFL1-UFBP1-CDK5RAP3和UFSP2-C1orf27两个多蛋白复合物在ER膜上组装，控制UFMylation系统在ER胞质面的活性。C1orf27是ER锚定蛋白，与UFSP2相互作用调节其ER定位。UFSP2敲除降低C1orf27表达，而C1orf27敲除更显著抑制UFSP2表达，表明两者相互稳定。UFMylation系统调节细胞周期、核信号、DNA损伤反应、基因组完整性、细胞发育和死亡等过程。在ER水平，它调控ER-RQC、ER自噬、ER应激和ER相关蛋白降解（ERAD），维持ER稳态。近年发现该系统还控制蛋白质从ER输出，包括α-突触核蛋白的非经典分泌、脂蛋白分泌以及选择性GPCR运输。

**2. UFMylation系统在GPCR生物合成运输中的作用**
**2.1 UFMylation级联控制新生GPCR从ER到高尔基体的输出**
GPCR在ER中合成，经修饰、折叠和组装后通过ER质量控制，从ER输出并运往高尔基体和细胞表面。尽管已发现许多调节蛋白和受体内部结构决定因素，但GPCR如何从ER靶向细胞表面仍不清楚。筛选实验显示，UFM1耗竭显著阻断研究中的12个GPCR中6个的ER-高尔基体转运，而不影响3个非GPCR血浆膜蛋白。使用保留选择性钩（RUSH）实验量化，单独耗竭UBA5、UFL1、UFSP2或UFBP1也产生类似抑制。UFBP1自身UFM1化部分参与其功能，而RPL26的UFM1化则非必需。受体输出缺陷不伴随未折叠蛋白反应（UPR）或受体降解，提示该作用机制不同于维持ER稳态。

**2.2 UFMylation影响GPCR向COPII囊泡的募集**
COPII囊泡介导新合成的分泌蛋白和膜蛋白从ER输出。组装始于ER输出位点（ERES），Sar1 GTP酶被Sec12激活后募集Sec23-Sec24异二聚体形成内层，再募集Sec13-Sec31形成外层驱动出芽。膜货物通过直接结合Sec24被浓缩，可溶性货物则依赖受体。研究表明，UFMylation系统在COPII囊泡处控制GPCR输出。所研究的GPCR均依赖COPII囊泡，但不同GPCR在囊泡中富集能力不同，AT₁R、AT₂R和CXCR4可被高效募集，α_2B-AR和β₂-AR则不明显。UFBP1和CDK5RAP3经邻近生物素化鉴定存在于COPII囊泡。UFBP1可生物素化Sar1B、Sec24A、Sec24B和Sec24D，但不包括Sec24C。UFBP1和UFL1可能与Sar1物理关联。耗竭UFMylation成分显著抑制Sar1-BirA*对GPCR的生物素化，但不影响COPII囊泡整体生成，因此UFMylation系统增强COPII对新生GPCR的捕获。

**2.3 GPCR与UFBP1-UFL1复合物的相互作用控制其在ER的输出和分选**
GPCR超家族成员众多且共享保守结构拓扑，它们如何在ER分选是重要问题。不同GPCR可能利用不同运输途径。UFMylation系统仅影响部分GPCR，提示其具有分选能力。例如，依赖UFMylation的α_2A-AR和AT₁R直接与UFBP1和UFL1相互作用，而不依赖的AT₂R则不结合。AlphaFold 3结构预测显示α_2A-AR通过其C末端（CT）和第三胞内环（ICL3）与UFBP1和UFL1相互作用。将AT₁R的CT融合至水疱性口炎病毒糖蛋白（VSVG），可将其运输从UFMylation非依赖转变为依赖。这表明货物GPCR与UFMylation成分之间的物理关联驱动其在COPII囊泡处的募集和选择。

**2.4 C1orf27-UFSP2复合物定位GPCR以进行UFMylation调控**
C1orf27与UFSP2形成复合物，将去UFMylation机制锚定在ER。耗竭C1orf27或UFSP2对GPCR ER-高尔基体运输产生相似抑制，提示二者协同作用。C1orf27直接与货物GPCR（如α_2A-AR和α_2B-AR）结合，UFSP2通过C1orf27间接接触受体，形成线性三元复合物GPCR-C1orf27-UFSP2。α_2A-AR通过CT和ICL3与C1orf27作用，而α_2B-AR仅通过ICL3。线虫中的同源蛋白ODR4（C1orf27同源物）和ODR8（UFSP2同源物）对嗅觉受体ODR10运输至纤毛至关重要，且ODR4直接结合ODR10，并募集ODR8至ER膜。这显示该机制在进化上保守。但UFSP2/ODR8催化活性的必要性存在物种差异：线虫中不依赖酶活性，而哺乳动物细胞中催化失活的UFSP2突变体不能挽救敲除细胞，并在野生型细胞中发挥显性负性作用，阻断受体ER输出。可能的解释包括不同底物、分子伴侣功能或实验方法差异。

**3. 靶向GPCR生物合成运输和UFMylation的治疗潜力**
大多数GPCR的功能目的地是细胞表面，ER输出是GPCR成熟过程中的限速步骤，决定表面受体丰度及信号强度。GPCR生物合成运输失调与多种疾病相关，许多由自然突变导致受体错误折叠而滞留ER，如视网膜色素变性（视紫红质）、X连锁肾性尿崩症（NDI）（血管加压素V₂受体）、先天性低促性腺激素性性腺功能减退（促性腺激素释放激素受体）、肥胖（黑皮质素3/4受体）等。例如V₂R有300多个突变，多数导致NDI。一些细胞通透性非肽类V₂R拮抗剂如托伐普坦、沙他伐坦等可作为药理学伴侣，挽救部分突变体表面表达。UFMylation系统在疾病中的作用已通过动物模型广泛研究，包括核心成分缺失和底物敲入突变。小分子UBA5抑制剂如DKM 2-93已在临床前模型中用于癌症治疗。UFMylation相关疾病包括2型糖尿病、胰腺外分泌病、非酒精性脂肪肝、心脏病、炎症性肠病和肾病，可能源于ER稳态紊乱；另一些神经发育障碍和神经退行性疾病与核心成分突变、蛋白质稳态失调及α-突触核蛋白和Tau积聚有关。由于GPCR几乎调节所有细胞功能，这些疾病可能部分归因于UFMylation缺陷导致的GPCR运输异常，因此阐明三者的功能交叉将为新一代治疗提供基础。

**4. 结论性评论**
总之，UFMylation级联通过ER膜上两个直接结合货物GPCR的复合物——UFBP1-UFL1和C1orf27-UFSP2——调控GPCR从ER的输出，可能促进其向COPII囊泡的募集。这些复合物提供了协调货物识别并将受体导向UFMylation机制的分子平台。此外，许多GPCR在ER中发生同源二聚化，C1orf27可与UFBP1相互作用，提示多个UFMylation成分与货物GPCR可能组装成更大复合物，精密调控GPCR ER输出。

尽管有这些引人注目的发现，仍有几个关键问题尚未解决。第一，关键底物鉴定：由于RPL26的UFM1化对GPCR运输并非必需，且UFBP1功能仅部分依赖自身UFM1化，决定GPCR以依赖UFMylation方式从ER输出的关键UFM1底物仍有待发现。第二，内源性GPCR运输的验证：目前多数研究使用过表达模型，可能超出内源运输机器的能力，监测低表达水平下内源性GPCR沿分泌途径的输出动力学仍是技术挑战。第三，货物选择机制：UFMylation系统如何选择性识别货物GPCR，并将其与非GPCR膜蛋白及彼此区分，是该领域的基本问题。