《Cells》：Disruption of p-AKT/ERβ-Mediated Midkine Signaling Promotes the Antimetastatic Effects of Timosaponin AIII in Nasopharyngeal Carcinoma Cells
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背景：鼻咽癌（NPC）是一种高度转移性的上皮恶性肿瘤，晚期疾病治疗选择有限。Timosaponin AIII（TSAIII）是一种天然甾体皂苷，具有抗肿瘤活性；然而，其对NPC进展的作用及分子机制尚不清楚。方法：采用细胞生长、集落形成、Annexin V/PI
背景：鼻咽癌（NPC）是一种高度转移性的上皮恶性肿瘤，晚期疾病治疗选择有限。Timosaponin AIII（TSAIII）是一种天然甾体皂苷，具有抗肿瘤活性；然而，其对NPC进展的作用及分子机制尚不清楚。方法：采用细胞生长、集落形成、Annexin V/PI和Transwell实验评估细胞活力、增殖、凋亡、迁移和侵袭。人类趋化因子阵列和癌症基因组图谱（TCGA）分析确定Midkine（MDK）为TSAIII的潜在分子靶点及其在NPC中的临床相关性。采用Western blotting、qRT-PCR、免疫荧光和染色质免疫沉淀（ChIP）实验研究潜在信号机制。在C.B17-SCID小鼠中进一步评估抗转移活性。结果：TSAIII抑制NPC细胞迁移和侵袭，细胞毒性极小，伴随p-AKT（Ser473）表达降低、雌激素受体β（ERβ）核定位减少和MDK表达下降。Wortmannin增强这些效应，而TSAIII减弱潜伏膜蛋白1（LMP1）诱导的信号传导。体内实验中，TSAIII显著减少肺转移而无明显毒性。结论：TSAIII通过靶向LMP1/p-AKT/ERβ/MDK信号轴抑制NPC转移，支持其作为NPC抗转移治疗候选药物的潜力。
鼻咽癌（NPC）是一种起源于鼻咽上皮衬里的恶性肿瘤，具有明显的地理和种族分布特征，高发于东南亚和中国南方。NPC的病因涉及遗传易感性、Epstein-Barr病毒（EBV）感染以及咸鱼消费和木尘暴露等环境因素。NPC以侵袭性行为、早期淋巴扩散和频繁远处转移为特征，显著增加了治疗难度。潜伏膜蛋白1（LMP1）是EBV编码的致癌蛋白，在NPC发病机制中发挥核心作用。LMP1作为模拟CD40信号的组成性活性受体，激活包括NF-κB、MAPK和PI3K/AKT在内的多个下游通路，共同促进细胞增殖、抑制凋亡、增加侵袭和促进免疫逃逸。LMP1表达与NPC肿瘤进展、转移和不良预后密切相关。Midkine（MDK）是一种肝素结合生长因子，通常在胚胎发育期间表达。MDK过表达通过增加细胞增殖、血管生成和转移以及调节免疫微环境促进肿瘤进展。在NPC中，MDK表达升高与微血管密度增加和总生存期较差相关。值得注意的是，NPC细胞来源的外泌体miR-9可通过靶向MDK和调节内皮细胞中的PDK/AKT信号通路抑制血管生成，突显了MDK在肿瘤血管生成中的作用。先前研究表明，雌二醇促进ERβ募集至MDK启动子，增强MDK转录和肺腺癌细胞中的上皮-间质转化。新兴证据表明LMP1和MDK在NPC肿瘤微环境中存在潜在串扰。LMP1诱导的信号可能上调MDK等因子，从而通过PI3K/AKT等重叠通路促进血管生成和肿瘤侵袭性。Timosaponin AIII（TSAIII）是一种甾体皂苷，主要从知母根茎中分离，是东亚医学中用于解热和抗炎的传统草药。近期研究揭示了其在多种肿瘤类型中的显著抗癌特性，包括乳腺癌、肝癌和结直肠癌。TSAIII的抗癌潜力归因于多种机制，包括诱导凋亡、抑制细胞增殖、抑制血管生成以及调节PI3K/Akt、MAPK和NF-κB等关键致癌信号通路。这些发现表明TSAIII是一种有前景的天然化合物，在癌症治疗中具有潜在治疗应用。然而，其对NPC细胞的作用和分子机制仍知之甚少。因此，本研究旨在评估TSAIII对NPC细胞迁移和侵袭的体外抑制作用，并研究LMP1/p-AKT/ERβ/MDK信号通路在这些效应中的潜在参与。此外，研究人员评估了TSAIII治疗在体内的抗转移疗效和安全性。
研究人员开展了以下研究：采用MTT法检测TSAIII（0-5 μM）处理24或48 h后NPC-BM和NPC-39细胞的生长率；采用集落形成实验检测TSAIII（0-5 μM）处理7天后细胞增殖能力；采用Annexin V/PI流式细胞术检测TSAIII（0、1、3、5 μM）处理24 h后的细胞凋亡；采用Transwell实验（Boyden小室，8.0 μm聚碳酸酯膜，迁移实验18 h、侵袭实验24 h，侵袭实验膜预涂5% Matrigel）评估细胞迁移和侵袭能力；采用人类趋化因子阵列（31种固定化抗趋化因子抗体）筛选TSAIII靶向蛋白；采用ELISA检测MDK分泌水平；采用免疫荧光染色（400×或630×放大）观察MDK和ERβ的定位；采用Western blot检测ERα、ERβ、p-AKT-Thr308、p-AKT-Ser473、t-AKT、MDK、LMP1和β-actin蛋白表达；采用RT-qPCR检测MDK mRNA水平（以GAPDH为内参，2?ΔΔCt法计算）；采用ChIP实验检测ERβ与MDK启动子的结合；采用GEO数据库（GSE12452和GSE53819）和TNMplot数据库分析MDK在NPC组织中的表达；采用AKT过表达质粒（Ov-AKT，0.5 μg）转染NPC-BM细胞；采用C.B17-SCID小鼠（5周龄雄性，每组5只）尾静脉注射NPC-BM细胞（1×10? cells/100 μL PBS）建立肺转移模型，7天后口服灌胃TSAIII（5或10 mg/kg，每周两次，连续10周），实验结束后处死小鼠，收集肺、心、肝、脾、肾进行H&E染色和免疫组化（Ki-67、p-AKT、MDK）分析。
研究结果如下：
3.1 TSAIII对NPC细胞增殖、凋亡和转移特性的影响：TSAIII（0-5 μM）处理24和48 h对NPC-BM和NPC-39细胞活力无显著影响；TSAIII显著减少两种细胞集落形成，表明可能损害长期增殖潜力；流式细胞术显示TSAIII即使在高浓度（5 μM）也不显著诱导凋亡；TSAIII（1-5 μM）显著抑制NPC-BM和NPC-39细胞的迁移和侵袭（p < 0.01），表明明显的抗转移潜力。
3.2 TSAIII对NPC细胞MDK表达及MDK诱导的迁移和侵袭的抑制作用：蛋白质阵列显示TSAIII（5 μM）处理后MDK蛋白水平显著降低；qRT-PCR和ELISA证实TSAIII显著下调MDK mRNA和分泌表达；免疫荧光证实TSAIII处理细胞中细胞质MDK蛋白水平降低；重组人MDK（Rh-MDK，200 ng/mL）显著增加NPC细胞迁移和侵袭，而TSAIII共处理部分逆转Rh-MDK的促迁移和促侵袭效应；GEO数据集（GSE53819和GSE12452）和TNMplot分析显示MDK在NPC肿瘤组织中显著高于正常组织。结果表明MDK在NPC中过表达并促进肿瘤细胞迁移和侵袭，TSAIII可能部分通过下调MDK发挥抗转移作用。
3.3 TSAIII对NPC细胞核ERβ表达及ERβ与MDK启动子结合的抑制作用：Western blot显示TSAIII（5 μM）显著降低NPC-BM和NPC-39细胞核内ERβ而非ERα表达；免疫荧光显示对照组细胞ERβ强核定位，TSAIII处理后显著减弱；MDK启动子转录起始位点上游?405至?393位置鉴定出推定的ERβ结合区域；ChIP实验显示对照组ERβ富集于MDK启动子，TSAIII（5 μM）处理后结合显著减少。结果表明TSAIII通过下调核ERβ和抑制ERβ与MDK启动子结合来抑制MDK表达。
3.4 TSAIII对NPC细胞中AKT活化介导的ERβ/MDK表达的抑制作用：Western blot显示TSAIII（5 μM）显著降低p-AKT（Ser473）磷酸化水平，而总AKT和p-AKT（Thr308）不变，表明选择性抑制AKT活化而非表达；TSAIII与AKT抑制剂wortmannin共处理增强对p-AKT（Ser473）活性、MDK表达和核ERβ蛋白的抑制，并增强抗侵袭效果；转染组成性活性AKT质粒（Ov-AKT）恢复AKT活性并逆转TSAIII诱导的MDK表达抑制、迁移和侵袭抑制。结果表明TSAIII可能至少部分通过抑制p-AKT/ERβ/MDK表达信号通路发挥抗侵袭作用。
3.5 TSAIII通过靶向p-AKT/ERβ/MDK信号轴抑制LMP1驱动的NPC-39细胞迁移和侵袭：LMP1显著增加细胞迁移和侵袭，TSAIII以剂量依赖方式显著抑制这些效应；Western blot显示TSAIII降低LMP1表达NPC-39细胞中MDK表达和AKT磷酸化而不影响总AKT水平；免疫荧光显示LMP1促进ERβ核积累，TSAIII处理后显著减少；核蛋白Western blot证实TSAIII暴露后核ERβ表达降低；TSAIII与wortmannin共处理对LMP1诱导的NPC-39细胞迁移和侵袭显示增强抑制效果。结果表明TSAIII通过抑制MDK/p-AKT/ERβ信号通路抑制LMP1介导的迁移和侵袭。
3.6 TSAIII对NPC细胞肺转移的抑制作用：NPC-BM荷瘤小鼠给予TSAIII（0、5、10 mg/kg）后，TSAIII治疗组肺部可见转移性肿瘤结节数显著减少，呈剂量依赖性下降，而体重不变，表明低全身毒性；组织学检查显示TSAIII治疗减少肿瘤负荷和Ki-67染色，表明肿瘤细胞增殖减少；TSAIII治疗小鼠肺转移灶中磷酸化AKT和MDK表达显著降低；心、肝、脾、肾H&E染色未见明显病理改变，进一步支持TSAIII给药的安全性。结果表明TSAIII通过抑制MDK/p-AKT信号通路有效抑制NPC肺转移。
讨论部分总结：本研究证明TSAIII通过下调MDK/p-AKT/ERβ信号选择性抑制NPC细胞转移相关特性，在高达5 μM剂量下对增殖和凋亡影响极小。与先前报道一致，TSAIII在抑制迁移、侵袭和集落形成能力方面比降低细胞活力更有效。在肾细胞癌细胞中，TSAIII（<8 μm）不显著改变细胞活力和周期分布，但抑制迁移侵袭，伴随PI3K抑制；在骨肉瘤细胞中，TSAIII抑制迁移和侵袭而不减少细胞生长或凋亡。虽然TSAIII可在较高浓度或不同肿瘤细胞中诱导凋亡和细胞周期阻滞，但NPC细胞系在5 μM以下未出现凋亡或细胞周期阻滞，提示这些细胞在较低浓度下对这些效应敏感性降低，或者TSAIII在亚细胞毒性剂量下发挥抗转移活性，突显其作为潜在有利治疗药物的价值。MDK作为下游靶点的鉴定得到NPC和其他癌症研究的支持。外泌体miR-9通过靶向MDK和减弱PDK/AKT通路抑制NPC肿瘤血管生成。在非小细胞肺癌中，MDK促进血管生成和转移，支持EMT和NF-κB活化；靶向MDK减少迁移、血管生成并改善动物模型生存。因此，TSAIII下调MDK mRNA和蛋白表达、通过减少ERβ结合降低MDK启动子活性以及抑制p-AKT（Ser473）的发现与MDK/p-AKT作为驱动NPC细胞转移轴的广泛文献一致。ERβ在NPC中的作用表征较少，尽管ER信号已涉及类似头颈癌。ERβ已被证明调节AKT信号并影响乳腺癌转移相关基因转录。本研究结果提示核ERβ在驱动MDK表达中的特定作用，TSAIII减少核ERβ及其与MDK启动子的结合。AKT是大多数癌症中过度活跃的原癌基因，完全激酶活化依赖Thr308（由PDK1介导）和Ser473（由mTORC2介导）两个关键残基的磷酸化。研究人员检测了两个残基以确定TSAIII是广泛抑制AKT活化还是选择性干扰特定调控机制。观察到TSAIII降低AKT Ser473磷酸化而不影响Thr308磷酸化，表明选择性抑制完全活化。AKT通路调节是TSAIII文献中反复出现的主题。在紫杉醇耐药癌细胞系中，以及在RCC细胞中，TSAIII的抗迁移/侵袭效应部分通过抑制AKT信号介导。未来研究MDK受体参与和下游信号传导对于完全阐明该调控网络是必要的。大量证据支持AKT与ER之间的调控相互作用。AKT直接在Ser167磷酸化ERα，以配体非依赖方式增强其转录活性。类似地，Khatpe等报道生长因子介导的PI3K/AKT通路活化通过磷酸化依赖机制增强ERα反式激活。新兴证据表明AKT信号也调节ERβ功能。在细胞模型中，PI3K/AKT通路活化增强ERβ介导的转录活性，而AKT药理学抑制减弱ERβ依赖的报告基因表达。这些发现支持AKT作为ER信号上游调节因子的生物学合理性。另一个重要考虑是NPC中病毒癌基因的相互作用。TSAIII通过MDK/p-AKT/ERβ抑制LMP1诱导的迁移和侵袭的数据具有重要意义，因为LMP1是NPC转移和EMT的主要驱动因素。LMP1已被证明在NPC中激活PI3K/AKT信号通路；MDK在该通路中的特定参与可能是本研究的新发现。因此，TSAIII似乎在LMP1驱动的致癌网络中既作用于上游（调节ERβ的启动子结合）又作用于下游（AKT信号），可能使其成为EBV介导转化的有前景拮抗剂。体内数据显示减少肺转移、降低肺病灶中MDK和p-AKT表达以及无明显全身毒性，与其他癌症中TSAIII在乳腺癌异种移植模型和骨肉瘤转移模型中显示体内疗效的研究一致。然而，仍存在问题和局限性。第一，较高TSAIII浓度或较长暴露时间下凋亡和细胞周期阻滞在NPC中的作用需要进一步探索。第二，TSAIII的潜在脱靶效应（如对其他转录因子、共激活因子或替代AKT上游效应器）尚待阐明。第三，NPC模型中的生物利用度和药代动力学仍未表征；TSAIII相对疏水，一些研究表明递送系统改进可能增加其效果。第四，虽然体内发现支持TSAIII的抗转移潜力，但静脉注射模型主要评估肺定植，需要使用原位NPC模型进一步验证其疗效。最后，ERβ在NPC患者中的临床相关性、其在肿瘤和转移中的表达模式（核vs.质）以及MDK与ERβ和临床结局的关系值得更多研究。总之，本研究数据揭示TSAIII属于一类新兴的具有相对选择性抗转移效应的药物，主要通过抑制MDK/AKT轴介导，并可能与ERβ等转录调节因子的调节协同作用。研究结果既证实又扩展了TSAIII在其他癌症中的已知作用，并定义了NPC中的新分子靶点。未来工作可能集中在患者来源异种移植中确认这些通路、评估联合治疗（与AKT抑制剂、ER调节剂）以及改善TSAIII的递送和特异性。近期证据表明TSAIII作为免疫调节抗癌剂的转化潜力，通过抑制A2AR/CREB/FoxP3信号、减少CAR-Treg介导的免疫抑制和增强抗肿瘤免疫应答展示免疫调节潜力。此外，TSAIII促进CD8+ T细胞浸润、改善PD-1阻断反应并增强临床前模型中中央记忆T细胞形成。另一项研究发现TSAIII（KCT0002223）目前正在临床评估中作为潜在抗皱剂，具有抗炎和抗光老化特性，每日应用12周显著减少可见面部衰老迹象，特别是皱纹形成。总之，这些发现支持TSAIII作为癌症患者治疗的潜在辅助手段，特别是免疫治疗。此外，一项临床研究表明基线18F-FDG PET/CT代谢参数可作为预测NPC患者新辅助化疗（NAC）反应的有价值影像生物标志物。这些发现突显了NPC治疗反应评估的临床重要性，并为新型分子治疗策略的潜在转化提供了额外背景。在本研究中，TSAIII靶向p-AKT/ERβ/MDK信号通路可能代表抑制NPC进展和转移的有前景治疗方法。然而，该信号通路与18F-FDG PET/CT成像参数之间的关系尚未探索。需要进一步研究验证TSAIII在NPC中的免疫调节效应、评估其安全性和治疗疗效，并研究其与常规治疗联合时的潜在增强抑制效果。
研究结论部分翻译：研究结果表明，TSAIII可能抑制NPC细胞迁移和侵袭而不诱导显著细胞毒性。机制上，TSAIII处理与AKT磷酸化降低、ERβ核定位减少和MDK转录下降相关，提示LMP1相关p-AKT/ERβ/MDK信号的潜在参与。然而，潜在调控反馈机制尚待阐明。体内实验中，TSAIII减少肺转移而无 detectable 器官毒性（Figure 7），突显其作为NPC有前景的抗转移治疗候选药物的潜力。需要进一步机制和临床前研究验证这些初步发现。
