《Cells》：Revisiting Bivalve Mollusk Myogenesis: New Immunocytochemical Evidence from Magallana gigas
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本研究探讨了双壳类软体动物幼虫收缩装置的形成过程。由于缺乏能够选择性标记蛋白质及其结构的抗体，双壳类幼虫发育的分子层面研究受到显著制约。为解决这一问题，研究人员针对双壳类肌肉的主要蛋白质制备了多克隆抗体。采用免疫组织化学方法获取双壳类幼虫肌肉的高质量共聚焦图像
本研究探讨了双壳类软体动物幼虫收缩装置的形成过程。由于缺乏能够选择性标记蛋白质及其结构的抗体，双壳类幼虫发育的分子层面研究受到显著制约。为解决这一问题，研究人员针对双壳类肌肉的主要蛋白质制备了多克隆抗体。采用免疫组织化学方法获取双壳类幼虫肌肉的高质量共聚焦图像，以描述巨囊藻（Magallana gigas）发育过程中主要肌肉蛋白掺入收缩装置的情况。这些蛋白质在肌肉细胞中的出现并不均一，且出乎意料的是，包括横纹形成在内的肌肉结构形成过程中的主导蛋白为twitchin。所获发现支持如下假说：该蛋白类似于脊椎动物的titin（属于同一家族的蛋白质），可能在收缩装置的组装中发挥关键作用。与本研究检测到的另一种蛋白质myorod一样，twitchin被认为参与捕获态（catch state，软体动物平滑肌的一种能量高效状态）的形成。这些蛋白质存在于双壳类幼虫期横纹肌中的强有力证据，引发了关于这一重要进化适应起源的疑问。
双壳类软体动物（Bivalvia）约含15,000个物种，其共同特征为均具有可进入"捕获态"（catch state）的肌肉，该状态使成年双壳类牵缩肌（retractor）和平滑闭壳肌（smooth adductor）能以近乎零能量消耗维持张力，用于防御性闭壳。捕获机制被认为基于蛋白质，依赖于闭壳肌中两种独特蛋白：myorod（持力蛋白）和twitchin（捕获调控蛋白）；体外分子收缩模型实验表明，这些蛋白可在特定条件下交联收缩肌的细肌丝与粗肌丝，从而将收缩装置维持在收缩状态。然而，捕获态研究缺乏体内和显微层面的关键研究，捕获肌收缩装置的超分子组织研究亦较少，其肌生成仅有零星报道。目前已知双壳类幼虫发育过程中会形成临时肌肉系统随后解体，该系统主要由横纹肌而非平滑肌组成，可能反映软体动物肌肉系统的进化历史；尽管肌纤维组织不同，幼虫肌肉表达的蛋白与成年软体动物平滑肌相同，如twitchin、肌球蛋白（myosin）和副肌球蛋白（paramyosin）等粗肌丝收缩装置蛋白的表达开始较早，免疫染色已证实其存在于幼虫闭壳肌和牵缩肌中，但蛋白形成的顺序及其随后掺入收缩装置肌丝的过程仍不清楚；myorod作为参与捕获态交联的关键蛋白，其在幼虫肌肉形成中的作用尚未充分阐明，原因是myorod与软体动物肌球蛋白由同一基因经可变剪接（alternative splicing）产生，难以区分，且直至近期才可能制备针对myorod独特区域的抗体（两者分子结构85%相同，共享相同的杆部和部分颈部结构域，但头部结构域差异显著）。此前对双壳类肌生成的研究多集中于肌肉系统形成的形态学描述，主要依赖荧光标记鬼笔环肽（phalloidin，丝状肌动蛋白标记物）染色；部分研究使用抗肌肉蛋白抗体观察贻贝（Mytilus trossulus）幼虫肌肉系统的形成与解体，但主要展示粗肌丝蛋白掺入横纹肌肌原纤维的过程，未充分阐明内在机制，深入理解需检查并比较幼虫中间发育阶段。本研究选择的巨囊藻此前虽经共聚焦显微镜全面分析，成功实现基于鬼笔环肽的幼虫肌肉系统发育可视化，但鉴定肌动蛋白以外收缩装置蛋白的部分并不成功，原因是所用市售抗体原为针对脊椎动物肌肉蛋白制备；缺乏针对无脊椎动物蛋白的市售抗体一直是此类研究的显著限制。本研究成功制备了一系列针对双壳类粗、细肌丝蛋白的特异性抗体（标记twitchin、肌钙蛋白C（troponin C）、myorod和肌球蛋白分子），得以阐明主要收缩蛋白如何出现并掺入软体动物幼虫肌肉的收缩结构。因此，本研究聚焦于利用针对分离纯化双壳类抗原制备的独特兔源抗体，对具有商业价值的巨囊藻肌肉系统发育进行详细的逐步分析，此前尚无此类研究。
研究人员从日本海东方湾采集成年巨囊藻和灰贻贝（Crenomytilus grayanus），经热休克诱导产卵，将5只牡蛎的精子与成熟卵母细胞在过滤海水（盐度28‰）中于17 °C受精，胚胎卵裂后于17 °C、5 L烧杯中培养并以气喷保持水体持续搅动，每两天换水；依据光镜下的形态学标准采集未受精卵、囊胚（受精后12 h）、早/中/晚担轮幼虫（分别为20、24、28 hpf）、早/中/晚面盘幼虫（分别为41、72 hpf和5 dpf）及足面盘幼虫（14 dpf）各阶段样本，56 hpf后每日投喂球等鞭金藻（Isochrysis galbana，100,000 cells/mL）。研究所用蛋白均按灰贻贝方法分离纯化：twitchin和myorod通过将收缩装置解离为细、粗肌丝并经硫酸铵盐析获得；troponin C通过氯化锂溶液提取细肌丝表面蛋白制备；twitchin和troponin C经离子交换色谱精细纯化；myorod经解聚—澄清与聚合—沉淀循环纯化，并经控制性蛋白酶解获得其独特C端结构域，该结构域与完整twitchin、myorod及troponin C分子一同用于制备一抗。采用经典动物免疫方案制备针对灰贻贝肌肉蛋白（myorod及其头部结构域、troponin C、twitchin，浓度100 mg/mL）的兔源多克隆一抗：抗原经SDS-PAGE检验后，首次皮下注射时与完全弗氏佐剂乳化、后续注射与不完全弗氏佐剂乳化以增强免疫应答，并经静脉给药；每种抗原用3只兔、共12只，每次注射总体积1 mL，初次免疫间隔2–4周；每次注射后10–14天从兔耳缘静脉采小量血样，以Western blotting（WB）法监测抗体效价，效价达1:5000–1:10,000后于麻醉下心脏穿刺采集终血并处死动物；血清分离后去除非特异性抗体，经固定化抗原柱亲和色谱纯化，纯化抗体经WB和免疫组织化学检验特异性，确认与牡蛎闭壳肌"肌原纤维"制备中其他蛋白无意外交叉反应；针对完整myorod分子的抗体与肌球蛋白分子存在预期交叉反应（两者氨基酸序列85%相似并共享杆状结构域），因此分析免疫染色结果时需比较抗完整myorod抗体与抗myorod头部结构域抗体的染色；抗体分装后于?80 °C或冻干于?20 °C长期保存。免疫化学方面，未受精卵与各期幼虫用4%多聚甲醛（溶于0.1 M磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4）于4 °C固定2 h，冷PBS洗三次；面盘幼虫期起固定前用过滤海水稀释至7.5%的MgCl?逐步松弛；样品保存于含0.03% NaN?的PBS中（4 °C）。采用间接免疫荧光结合激光共聚焦显微镜监测肌肉系统变化：兔源多克隆抗体（稀释1:1000–5000）标记成年贻贝肌肉粗、细肌丝蛋白，小鼠单克隆抗乙酰化α-微管蛋白抗体（Sigma；1:1000）或Alexa Fluor? 555鬼笔环肽（Invitrogen；1:1000）作为丝状肌动蛋白标记；早面盘幼虫期起样品于室温5% EDTA孵育60 min脱钙以减少抗体黏附于壳并改善免疫染色质量；样品于含10%正常山羊血清、0.25%牛血清白蛋白（BSA）、0.5% Triton X-100和0.03% NaN?的封闭液中4 °C过夜封闭，一抗孵育5天，PBS–Triton X-100洗涤（5次×10 min，4 °C），再与Alexa Fluor 647偶联山羊抗兔IgG和Alexa Fluor 488偶联山羊抗小鼠IgG（1:1000）4 °C过夜孵育；阴性对照省略一抗；鬼笔环肽常规加入二抗；样品PBS洗5次×10 min，0.1 μg/mL DAPI染核，PBS洗3次×15 min，甘油封片；每个发育阶段每种肌肉蛋白抗体至少检查50个胚胎。图像分析使用Zeiss Celldiscoverer 7共聚焦激光扫描显微镜（Axiocam 506，像素4.54 × 4.54 μm），物镜Plan-Apochromat 20×（NA 0.70）和50×（NA 1.2 W），激发波长385/30（DAPI）、469/38（AF488）、555/30（鬼笔环肽）、631/33（AF647）；宽场模式预览、共聚焦模式扫描；比较染色强度时采用相同采集与处理设置；图像分析用Imaris（V. 9.0.1），三维图像由Z切片经ImageJ（V. 1.53c）重建，每样品以1 μm间隔记录Z切片序列，经GIMP调整对比度和亮度并组合成图。
研究结果显示：3.1抗体表征——经WB法以巨囊藻闭壳肌洗涤"肌原纤维"（指从肌肉匀浆中分离的僵直细、粗肌丝复合物，非真正肌原纤维，故加引号）制备检测，膜转移和抗体染色显示与twitchin、myorod、肌球蛋白和troponin C对应的条带。3.2牡蛎幼虫肌肉系统的一般发育——经激光扫描共聚焦显微镜监测从未受精卵至足面盘幼虫的发育，肌肉蛋白免疫阳性信号最早见于中期担轮幼虫（24 hpf），早担轮幼虫期之前数据省略；早担轮幼虫（20 hpf）呈球形、下端略细，出现分隔上球部与下球部的纤毛环（原担轮），此期未见所测肌肉蛋白表达及F-actin信号；中期担轮幼虫（24 hpf）可见肌肉蛋白免疫阳性细胞，呈垂直方向聚集；晚期担轮幼虫（28 hpf）成肌细胞伸长并看似融合（需进一步研究）形成肌束，至D形面盘幼虫（41 hpf）发育为横纹缘膜牵缩肌，某些角度（顶部视图，星号）下缘膜牵缩肌似环绕胃的肌肉环；D形面盘幼虫因基部形成壳而呈特征性D形，顶部完全形成缘膜（运动器官）；72 hpf（中期面盘幼虫）三对发育良好的牵缩肌可见；牵缩肌至晚期面盘幼虫（5 dpf）才明显横纹化；前闭壳肌形成并明显分为两部分，视觉上缺乏横纹；消化系统清晰可见，由胃、口和肛门开口组成；至足面盘幼虫（14 dpf）出现部分横纹的后闭壳肌、连接外套膜与壳的外套膜边缘肌、外套膜牵缩肌和前腹牵缩肌，消化系统发育中的肌肉和消化团可见。3.3牡蛎幼虫肌生成早期肌肉蛋白模式的比较分析——标记粗肌丝蛋白（myorod、肌球蛋白、twitchin）的抗体最早在中期担轮幼虫（24 hpf）检出肌肉细胞，但肌肉蛋白出现并不均一：twitchin和完整myorod分子染色显示成肌细胞聚集、伸长，沿幼虫体垂直轴形成连续带，而myorod头部特异性抗体仅检出单个空间分隔的细胞；两种情况下蛋白均位于成肌细胞周边，据此认为中期担轮幼虫期结合完整myorod分子的抗体大多染色肌球蛋白分子；检测细肌丝蛋白（肌动蛋白和肌钙蛋白）的染色未显示特异性定位，抗肌钙蛋白抗体呈弥漫分布，鬼笔环肽未检出肌动蛋白；下一发育阶段（28 hpf）成肌细胞发生显著变化，含粗肌丝蛋白的细胞形成类似未来幼虫牵缩肌索的伸长结构，晚期担轮幼虫期这些细胞向腹侧迁移，顶面观新生染色模式似开放肌肉环；而抗肌钙蛋白抗体染色则见于幼虫体中央区、类似前一阶段表达粗肌丝蛋白的成肌细胞群，鬼笔环肽染色仍无结果。3.4面盘幼虫的肌原纤维生成与肌肉解剖——41 hpf（D形面盘幼虫）含主要粗肌丝蛋白（肌球蛋白、myorod、twitchin）的幼虫牵缩肌形成明显，此期仅twitchin呈明显横纹模式并组织为肌节；抗肌钙蛋白抗体染色也可见类似牵缩肌结构，但还影响幼虫组织周边的其他细胞；鬼笔环肽仍未检出肌动蛋白；肌动蛋白最早于中期面盘幼虫（72 h）检出，但染色均匀，与twitchin已形成的横纹模式和myorod正在形成的横纹模式形成对比，此期肌钙蛋白染色与肌动蛋白共定位并更局限于牵缩肌区；晚期面盘幼虫（120 hpf）所检全部收缩蛋白在幼虫缘膜牵缩肌结构中呈明确横纹模式，同时形成成对前闭壳肌，其染色除twitchin外未见横纹模式，twitchin染色可见一些宽间隔条带，可能记录到闭壳肌结构分化为平滑部和横纹部的最开始；足面盘幼虫（14 dpf）幼虫尺寸从40增至150 μm（增三倍以上），肌肉同步增大，后闭壳肌呈部分横纹，前闭壳肌明显同样分化，后闭壳肌直径最大、显著超过缘膜牵缩肌和前闭壳肌，缘膜牵缩肌显著延长、向缘膜延伸并大量分支；近外套膜边缘可见前腹牵缩肌，部分病例横纹清晰；沿壳缘走行的长而窄的外套膜边缘肌明显，与之垂直的短平滑外套膜牵缩肌末端分支；所有肌肉中均可检出粗、细肌丝蛋白，但此期可推定识别出缺乏肌动蛋白和肌钙蛋白标记（可能亦无表达）的消化团肌，该肌从壳顶延伸至外套膜并分为两大支，无横纹迹象。3.5牡蛎幼虫横纹肌中蛋白的结构组织——高倍下足面盘幼虫缘膜牵缩肌的粗肌丝蛋白（twitchin、myorod、肌球蛋白）沿肌全长形成均匀横纹模式；鬼笔环肽标记的肌动蛋白形成双线，两侧为较窄的粗肌丝蛋白阳性区，双线间为稍宽的无肌肉蛋白间隙；粗肌丝蛋白组织模式比较显示三者均定位于相同区域并由细肌丝两侧环绕，粗、细肌丝区在边缘轻度重叠；与足面盘幼虫缘膜牵缩肌双线横纹模式不同，面盘幼虫缘膜牵缩肌中肌动蛋白和肌钙蛋白形成与粗肌丝蛋白相似的均匀横纹模式，且两者占据区域完全重叠，可能因面盘幼虫期牵缩肌尺寸较小而更难观察到双横纹模式。
讨论部分：本研究首次利用针对分离双壳类抗原的一抗，详细逐步描述双壳类肌肉收缩装置中关键肌肉蛋白的出现与分布，时间分辨率高于此前对M. trossulus的研究；2019年对同种牡蛎的可比研究因使用针对兔蛋白制备的抗体未能实现高特异性组织染色，而本研究凭借针对双壳类肌肉蛋白的独特抗体，确定了牡蛎胚胎发生中关键肌肉蛋白可检出的顺序并追踪其组织化为收缩装置的过程；由于鬼笔环肽不能可靠区分肌动蛋白的细胞骨架型与肌肉型，故制备抗troponin C抗体，首次观察到双壳类幼虫发育中细肌丝的组装，但其作为特异性生肌标记的价值尚需进一步验证。4.1粗肌丝蛋白参与幼虫肌肉形成——文献报道双壳类幼虫肌肉蛋白合成早至囊胚期（twitchin和myorod，12 hpf）或早担轮幼虫期（肌球蛋白，17 hpf），但本研究仅在中期担轮幼虫（24 hpf）观察到明显收缩装置蛋白染色，与贻贝约30 hpf免疫染色可检出肌肉系统形成的报道一致；幼虫发育高度依赖温度、盐度和投喂等培育条件，故本研究同时依据时间和形态特征；24 hpf时twitchin信号明显更高、簇集于更多细胞且分布较肌球蛋白更少弥漫，主要见于细胞周边、清晰勾勒细胞边界，完整myorod抗体呈类似但更弥漫的模式，而针对myorod独特部分的抗体此时仅检出4个空间分隔的成肌细胞，与细肌丝晚期形成的早期数据一致，抗troponin C抗体此期染色微弱；尽管抗体识别顺序可能受亲和力、靶标可及性和构象变化影响，研究人员主要依据蛋白在收缩装置内的排列和分布评估其发育中的存在，并从结构和强度可比的后期推断抗体亲和力足够；据此确定粗肌丝蛋白在成肌细胞中出现和积累的顺序为twitchin最先，其次肌球蛋白，再次myorod，最后troponin，该序列可追溯至中期面盘幼虫收缩装置形成；twitchin也最先形成明显的伸长肌束并最先组织为纤维、呈横纹模式，与脊椎动物肌肉横纹形成中与twitchin同科的titin行为极为相似；myorod介导的肌肉结构至晚期担轮幼虫已达肌球蛋白可检出的组织水平，但两者的横纹分布模式直至晚期面盘幼虫才出现，约晚于twitchin 60 h；这些发现为twitchin可能作为双壳类肌肉收缩装置组装分子模板的假说提供了有力新证据，该过程酷似脊椎动物骨骼肌形成中titin作为收缩装置组装基础；titin已知与脊椎动物肌节各组分结合，但双壳类幼虫或成年肌肉中粗肌丝超微结构和twitchin在收缩装置内的定位尚未充分阐明，twitchin在双壳类肌肉收缩装置中的作用和位置仍不清楚，其是否如titin一样连接收缩装置结构的问题仍开放，twitchin与肌球蛋白、肌动蛋白、副肌球蛋白和myorod等多种肌肉蛋白相互作用的能力支持这一假设；本研究证实twitchin染色与肌球蛋白和myorod染色完全共定位，但这仅适用于肌节结构较易观察的幼虫横纹肌；幼体和成年双壳类肌肉的发育蓝图可能基本相似，因为发育中闭壳肌（晚期面盘幼虫）的横纹最早通过twitchin免疫染色清晰显示；幼虫和幼体双壳类平滑肌尚需进一步研究。4.2细肌丝蛋白参与幼虫肌肉形成——虽非首次报道双壳类肌肉细肌丝形成延迟，但本研究首次发现细肌丝表面调节蛋白的标记比肌动蛋白可检出早数十小时：troponin染色在41 hpf见于幼虫牵缩肌，而肌动蛋白掺入牵缩肌至72 h才明显，同时肌动蛋白的数量和分布提示其掺入肌丝的过程尚未完全完成（横纹尚不可辨）；这可能表明幼虫肌肉组织中细肌丝调节蛋白显著早于肌动蛋白本身出现，若属实，该蛋白合成顺序或可防止肌动蛋白多聚体合成期间肌球蛋白与之结合，为避免松弛条件下肌动蛋白与肌球蛋白的强（僵直）结合，应预先备好调节蛋白池；但鉴于晚期担轮幼虫和早面盘幼虫期troponin在幼虫组织中的独特分布（不同于粗肌丝蛋白分布模式），troponin可能参与双壳类早期发育中的信号或细胞运输过程，介导非肌肉蛋白与肌动蛋白的相互作用；本研究还首次表明，由于troponin的存在，双壳类幼虫肌肉细肌丝可能如成年平滑肌一样参与双重调节机制，故幼虫双壳类肌肉功能可能需要细（troponin）和粗（钙敏感性肌球蛋白）肌丝的双重调节；因此不能排除troponin的钙调节可能与双壳类肌肉捕获态的调节无直接关系，但该假说基于幼虫双壳类横纹牵缩肌不能进入捕获态的假设；本研究结果表明所有牡蛎肌肉在幼虫发育中均含twitchin和myorod，故可能具备捕获态能力；因此双壳类的捕获态可能是具横纹肌的软体动物进化过程中较早出现的功能实现，而非其平滑肌进化中获得的性状，但这些观察和假说需遗传、生化和生理学方法进一步证实。4.3幼虫缘膜牵缩肌肌节结构——所获首批高质量共聚焦图像可与M. trossulus发育研究比较，后者用空间谐波改进显微术（SHIM）而非共聚焦显微镜达到高细节；本研究的鬼笔环肽染色图像最接近成年扇贝横纹肌研究中的模式，但SHIM法显示的是肌球蛋白而非细肌丝蛋白分布；本研究通过显示肌肉肌动蛋白辨识出由两条紧密相邻线及其间较宽间隔组成的模式，认为该模式由顺序排列的肌节组成、宽间隙似为Z线，此解释在显示定位于较窄间隙的粗肌丝蛋白后尤为合理；相反，从扇贝收缩装置肌球蛋白分布模式解释成对汇聚区较困难，因其含肌球蛋白而非肌动蛋白；高倍扫描大多取自足面盘幼虫期牵缩肌，低倍扫描中模式清晰，但常因肌肉弯曲、倾斜或重叠而难以辨认；面盘幼虫期用于显示肌动蛋白与troponin共定位的扫描中观察到类似贻贝面盘幼虫牵缩肌的模式，肌动蛋白线间隔相等；因近期牡蛎发育研究图像分辨率低且缺乏高倍扫描，无法与本研究鬼笔环肽染色比较，日本扇贝发育研究同样缺乏高倍扫描，但相似双横纹模式可见于扇贝足面盘幼虫的大幅照片，因未行双重染色而难以识别；由于缺乏足够放大照片，无法详细检查更早期牵缩肌横纹模式，但该模式与本研究牡蛎及此前贻贝研究相似；此外，有作者基于电镜和共聚焦结果强调面盘幼虫和幼体扇贝松弛缘膜牵缩肌横纹周期相同，但未提供各区直接对应，可能因缺乏肌肉双重染色，这也可能对足面盘幼虫牵缩肌肌节间宽暗带提出疑问；研究肌节结构时研究人员有意改善肌肉图像质量（如单向激光移动和逐层顺序扫描所有通道等特定扫描参数，耗时更多），而拍幼虫总体图像时未应用这些参数，所获肌节图像模糊、错位，无法用于准确确定蛋白复合体相对位置，也无法就肌节内粗、细肌丝分布得出结论；因此共聚焦与SHIM法所得粗、细肌丝排列模式的差异需专门用SHIM法澄清；本研究免疫荧光染色幼虫扫描所记录模式与此前研究的差异源于双壳类幼虫肌肉收缩装置的结构差异（取决于发育阶段），面盘幼虫和足面盘幼虫两期肌动蛋白组织模式比较证实这一点；据此认为面盘幼虫期肌肉虽外观似成熟横纹肌，但随双壳类达成年仍进一步发育，其原因和目的尚待阐明，但肌节在功能长度未增情况下伸长可能与双壳类成为成年时肌肉需快速伸长有关；另一个需深入讨论的问题是足面盘幼虫期出现无肌动蛋白标记的肌肉以及幼虫牵缩肌远端肌动蛋白染色强度明显下降，两者均以肌肉部分或完全缺乏肌动蛋白染色为特征，研究人员认为其原因相同：如Dyachuk等所报道，消化团肌在双壳类胚胎发生足面盘幼虫期出现，由于两项研究均清楚表明肌肉形成始于粗肌丝蛋白出现、继而细肌丝蛋白，很可能此时这些肌肉中肌动蛋白尚未形成细肌丝，这也解释了抗troponin C抗体无法检出这些肌肉，同样可解释自早面盘幼虫期起分支生长的牵缩肌远端肌动蛋白标记适中；其他研究也报道幼虫肌肉远端与近端染色强度差异。鉴于双壳类闭壳肌主要具有捕获态这一特定收缩状态，其形成问题需单独讨论：与此前太平洋牡蛎发育研究一样，本研究观察到前闭壳肌在面盘幼虫期出现，但本研究与Yurchenko等文中双前闭壳肌形成约在72 hpf、晚于牵缩肌形成；而Li等对牡蛎发育的研究报道闭壳肌早至D形面盘幼虫期形成，但该研究发育时间线整体显著偏早（D形面盘幼虫约24 hpf，而本研究为41 hpf、Yurchenko等为36 hpf；晚期担轮幼虫几乎早一倍，16 hpf vs 本研究28 hpf），研究人员认为该发育速率差异源于环境条件：Li等研究在20–23 °C下发育，Yurchenko等为20 °C，本研究约16–17 °C，温度诱导的发育加速使Li等未能观察到牵缩肌与闭壳肌出现之间的中间阶段；总体而言，闭壳肌形成问题因平滑肌结构研究困难而需包括电镜在内的进一步研究。
结论部分译文：本研究成功在分子水平上研究了牡蛎（M. gigas）幼虫肌肉系统的形成与发育。研究人员发现收缩装置中的主导蛋白为twitchin，通过免疫测定法检测到该蛋白，并发现它是第一个掺入收缩结构并在幼虫横纹肌中形成横纹的蛋白。粗肌丝中的其余蛋白——肌球蛋白和myorod——表现出相似的掺入收缩装置阶段，尽管显著延迟。肌动蛋白分子最后在收缩装置中被检出，这支持文献数据。这特别值得关注，因为troponin C在肌肉细胞中存在的首批迹象被检出要早数十小时。造成这一延迟的因素需进一步研究，可能与他软体动物中肌球蛋白与肌动蛋白之间的高亲和力有关。有趣的是，在本研究中，troponin C并非软体动物肌生成过程最有效的指示物，因为其在幼虫发育早期呈弥漫分布，与正在形成的肌肉结构几乎没有相似之处，这提示troponin可能参与其他非肌肉过程，需进一步研究。然而，令人惊讶的发现是，参与成年软体动物平滑肌收缩装置钙调节系统的蛋白在幼虫肌肉中被检出。此外，负责成年双壳类肌肉捕获态的myorod和twitchin蛋白也存在于幼虫横纹牵缩肌中，这引发了关于双壳类平滑肌捕获功能起源的问题。所发现蛋白和结构的功能性问题仍开放：幼虫横纹肌能否进入捕获态尚不清楚，可通过软体动物幼虫生理实验解决；还需超微结构研究以澄清myorod和twitchin在幼虫牵缩肌中形成的结构是否与成年双壳类平滑肌收缩装置相匹配，同样方法可用于回答本研究中识别的双肌动蛋白带间窄区是否实际对应肌节Z线，并监测肌节形成过程。本研究还发现，幼虫横纹肌（牵缩肌）与幼体横纹肌（闭壳肌横纹部）的基本形成顺序相似，参与特征性横纹的首个蛋白似为twitchin；先粗肌丝蛋白、后细肌丝蛋白的相似顺序可能也见于平滑肌发育（如消化团肌所示）。单个肌肉内蛋白分布、蛋白在组织中积累而未掺入有序结构的机制、收缩装置的合成，以及蛋白掺入的实际顺序与所获酶免疫测定数据之间的一致性，是未来需解决的问题，本研究为此铺平了道路。
