苦荞来源新型双靶点DPP?IV/ACE抑制肽：从抑制动力学到细胞生物活性评价

《Foods》：Novel Dual DPP-IV/ACE Inhibitory Peptides from Tartary Buckwheat: From Inhibition Kinetics to Cellular Bioactivity

　　

摘要：2型糖尿病与高血压常合并发生，亟需多靶点干预策略。本研究采用虚拟?实验联合筛选流程，从苦荞（Fagopyrum tataricum）中鉴定出两种双功能二肽基肽酶?IV（DPP?IV）/血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽——VPIY和IPLIGF。VPIY对DPP?IV和ACE的半抑制浓度（IC50）分别为191.61±4.99?μM和140.85±4.35?μM，而IPLIGF对二者的IC50分别为291.43±4.29?μM和199.85±5.59?μM。基于全局非线性混合模型拟合的动力学分析表明，VPIY对DPP?IV表现为混合型抑制，对ACE则为非竞争性抑制；IPLIGF对DPP?IV呈非竞争性抑制，对ACE则表现为类竞争性抑制。分子对接进一步证实VPIY是一种外周结合、不与Zn2+配位的ACE抑制剂，而IPLIGF则直接与ACE的Zn2+配位，支持其竞争性抑制机制。值得注意的是，VPIY在Caco?2（人结直肠腺癌细胞）中的DPP?IV抑制效力较其酶学IC50增强了约5倍（IC50=38.03±2.23?μM）。两种肽均能在去甲肾上腺素损伤的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中恢复一氧化氮（NO）水平并抑制内皮素?1（ET?1）分泌，从而缓解内皮功能障碍。这些首次报道的来自苦荞的双功能抑制肽，尤其是VPIY，在Caco?2细胞上表现出强效的原位DPP?IV抑制活性及血管保护作用，为其作为代谢综合征功能性食品配料提供了科学依据。

研究背景与目的

2型糖尿病（T2DM）与高血压常伴随出现，共同加剧心血管并发症和肾衰竭风险。临床常用的二肽基肽酶?IV（DPP?IV）抑制剂（如西格列汀）和血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂（如卡托普利）虽有效，但长期服用伴有胃肠道不适、高钾血症等副作用，促使研究者寻求安全、天然的膳食来源生物活性化合物。食物源生物活性肽因分子量小、易吸收、多功能活性和良好安全性，成为管理代谢紊乱的候选分子。苦荞（Fagopyrum tataricum）是中国西南地区广泛种植的药食同源传统作物，富含优质蛋白、黄酮类和手性肌醇。已有研究分别从苦荞蛋白水解物中鉴定出DPP?IV抑制肽和ACE抑制肽，但尚未见关于苦荞来源DPP?IV/ACE双功能肽的报道。由于DPP?IV偏好N端含脯氨酸或疏水残基的短肽，而ACE优先结合C端含芳香族或疏水氨基酸的肽段，两类酶的结构偏好差异使得天然序列同时满足两种识别基序极为困难，双功能肽的筛选面临低命中率瓶颈。现有双功能肽研究多依赖劳动密集型水解物分级分离、命中率低，且缺乏细胞水平的抑制活性与血管内皮保护验证。因此，研究人员假设，以预验证的苦荞DPP?IV抑制肽库为基础，结合靶向虚拟?实验联合流程，可高效突破低命中率瓶颈，理性发现新型双功能肽。

研究方法概述

研究人员整合了计算机辅助结构过滤、双靶点预测建模（StackDPPIV和AHTpin平台）、理化性质与安全性评估、固相合成，随后采用酶促动力学分析、分子对接、Caco?2细胞原位DPP?IV抑制实验以及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）内皮功能保护实验，系统表征了所鉴定肽的抑制机制与生物学潜力。

研究结果

3.1 双功能肽的虚拟筛选：研究人员对37条已知苦荞DPP?IV抑制肽进行基于ACE抑制基序的过滤，保留链长3?8个残基、N端为Val/Ile/Leu/Phe/Trp且疏水氨基酸占比≥50%的16条候选肽。经StackDPPIV和AHTpin双靶点预测后，14条肽进入后续评估。所有候选肽的疏水性指数（GRAVY）适中至偏高，等电点（pI）落在4.04?6.22的生理范围内，且经ToxinPred和AllerCatPro预测均为无毒、无致敏性。

3.2 双功能肽的筛选：体外预筛显示，仅VPIY和IPLIGF在1?mg/mL浓度下同时对DPP?IV和ACE的抑制率超过30%，命中率为5.4%（2/37），但仍显著高于随机筛选（<1%）。这两种肽是首次报道的来源于苦荞的DPP?IV/ACE双功能抑制肽。

3.3 酶学IC₅₀测定：VPIY对DPP?IV和ACE的IC₅₀分别为191.61±4.99?μM和140.85±4.35?μM；IPLIGF的相应值分别为291.43±4.29?μM和199.85±5.59?μM。两种肽均呈剂量依赖性抑制，Logit模型拟合优度（Nagelkerke伪R2）≥0.95。

3.4 Caco?2细胞中增强的DPP?IV抑制：在Caco?2细胞原位实验中，VPIY的DPP?IV抑制IC₅₀降至38.03±2.23?μM，较无细胞酶学测定增强约5倍；IPLIGF的IC₅₀也降至115.06±1.89?μM，降低约2.5倍。这一差异可能与肽?膜相互作用、细胞表面局部酶浓度或肽稳定性有关。

3.5 HUVEC内皮保护效应：去甲肾上腺素（NE，0.5?μM）诱导HUVEC内皮功能障碍，表现为NO水平显著下降、内皮素?1（ET?1）水平升高。阳性对照卡托普利（1?μM）可逆转此变化。VPIY和IPLIGF（100和200?μM）均能剂量依赖性地提高NO水平并降低ET?1水平，且在持续NE刺激下仍有效。VPIY的效果优于IPLIGF。

3.6 细胞相容性评估：CCK?8实验显示，VPIY和IPLIGF在Caco?2细胞（0.125?1?mg/mL）和HUVEC（100?400?μM）中均未引起显著细胞毒性，细胞活力与对照组相当。

3.7 酶促抑制动力学：全局非线性回归分析揭示，VPIY对DPP?IV为偏向竞争性的混合型抑制（α=2.84，95%CI不包含1），对ACE为非竞争性抑制（α=1.10，95%CI包含1）。IPLIGF对DPP?IV为非竞争性抑制（α=1.43，95%CI包含1），对ACE则为类竞争性混合抑制（α=6.84，95%CI不包含1）。Lineweaver?Burk双倒数图与上述结果一致。

3.8 分子对接揭示的结合模式：VPIY与DPP?IV形成6个氢键，同时接触底物结合区（Arg125）和催化装置（Ser630）；与ACE仅在外周残基（Gln369、Lys511、Gln281）形成3个氢键，不直接配位Zn²⁺，与其非竞争性动力学一致。IPLIGF与DPP?IV仅在外周残基（Glu205、Lys554、Trp629）形成4个氢键，不接触催化Ser630；与ACE则直接通过C端羰基氧配位Zn²⁺（2.2??），并与His383、His387等形成5个相互作用，支持其竞争性抑制特征。

讨论与结论

本研究首次从苦荞中鉴定出VPIY和IPLIGF两种DPP?IV/ACE双功能抑制肽，它们不仅能同时抑制两种酶的活性，还能在NE损伤的HUVEC中恢复NO/ET?1平衡，改善内皮功能障碍。VPIY在无细胞酶学实验、Caco?2细胞原位DPP?IV抑制及HUVEC内皮保护中均优于IPLIGF，其优势源于更小的分子量（四肽vs六肽）、偏向竞争性的DPP?IV抑制动力学以及外周非Zn²⁺配位的ACE结合模式。分子对接为动力学结果提供了结构层面的合理解释，但静态对接分数与动态酶抑制效力并不线性对应，实际抑制效能受诱导契合构象变化、溶剂化效应、细胞摄取和肽酶稳定性等多因素影响。在食物源双功能肽领域，VPIY和IPLIGF展现出中等但有前景的活性，尤其VPIY凭借其紧凑的四肽结构和在细胞模型中的强效活性，有望作为针对代谢综合征的功能性食品配料。未来研究应聚焦于体内药代动力学和抗高血压/抗糖尿病功效验证，以及细胞内信号中介（如PI3K/Akt/eNOS磷酸化）的直接定量分析，以全面阐明其作用机制。