《Foods》：Machine Learning-Assisted Protein Redesign and Codon Optimization for Soluble Expression of Human Lactoferrin in Escherichia coli
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在大肠杆菌（E. coli）中生产重组乳铁蛋白（LF）受限于溶解性差和包涵体形成。为解决此问题，研究人员建立了一种计算-实验工作流，将蛋白质重设计与结构筛选同基于深度学习的密码子优化策略相结合。候选突变体使用SurfSol筛选，并使用AlphaFold 3进行
在大肠杆菌（E. coli）中生产重组乳铁蛋白（LF）受限于溶解性差和包涵体形成。为解决此问题，研究人员建立了一种计算-实验工作流，将蛋白质重设计与结构筛选同基于深度学习的密码子优化策略相结合。候选突变体使用SurfSol筛选，并使用AlphaFold 3进行结构评估。随后，将双向门控循环单元（BiGRU）模型与五种算法进行基准比较。在测试子集比较中，BiGRU模型获得最高的受试者工作特征曲线下面积（ROC-AUC）和平均精确率（AP）值，记录的ROC-AUC为0.777，AP为0.720。定性Western blot筛选在大肠杆菌（E. coli）测试构建体中检测到ELF2可溶组分的抗His反应条带。在脂多糖（LPS）刺激的NCM460细胞中，用ELF2衍生并经镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）富集的制备物处理与较低的白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平以及较高的白细胞介素-10（IL-10）水平相关。将这些细胞因子变化归因于重设计LF需要蛋白质鉴定和纯度评估。尽管如此，定性表达筛选支持ELF2作为进一步表征的有前景候选。
论文主体内容解读：乳铁蛋白（LF，一种铁结合糖蛋白）具有抗菌、抗炎和免疫调节等特性，在婴儿营养、功能食品和生物制药中受到关注。商业LF多来自天然乳源，但存在生产效率低、纯化成本高和批间变异等问题；人乳铁蛋白（hLF）与人乳来源受限及伦理和物流约束相关，因此重组生产成为可扩展供给的替代途径。大肠杆菌（E. coli）因生长快、遗传操作简便和培养成本低而成为常用表达平台，大肠杆菌Nissle 1917（EcN，益生菌底盘）也被探索用于异源生物分子生产。然而，hLF作为真核蛋白在细菌胞质中易错误折叠和聚集，形成包涵体（inclusion bodies，错误折叠蛋白聚集形成的不可溶复合物），并受密码子使用偏好影响翻译动力学和共翻译折叠，导致可溶产量受限。仅进行密码子替换可能不足，需要在蛋白质和编码序列层面协同优化。传统密码子优化主要依赖密码子适应指数（CAI）等静态统计指标，难以充分反映编码序列与宿主翻译机器的相互作用，改进密码子适应并不总转化为更好的可溶表达。基于此，研究人员开展整合蛋白质重设计、结构筛选和BiGRU引导的同义密码子优化研究，并在E. coli中实验评估可溶表达，同时在LPS刺激的NCM460细胞中检测IL-6、TNF-α和IL-10，以提供优先筛选具有良好可溶表达谱hLF构建体的计算-实验框架。
关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员建立计算-实验工作流，以hLF序列（UniProt P02788）为起点，用ProteinMPNN在保留关键铁结合区域的约束下重设计并生成1000个候选；用SurfSol预测溶解度并排序，AlphaFold 3预测结构，PyMOL比较RMSD和TM-score，BIOVIA Discovery Studio分析表面疏水性和离子化；密码子表达数据集来自Ding等公开数据集并经内部整理为4281条唯一编码序列，按约7:2:1划分训练、验证和测试集；提取61个有义密码子频率、tAI、CAI和GC含量等64个特征，比较Transformer、BiGRU、多层感知机（MLP）、随机森林、支持向量机（SVM）和XGBoost；用BiGRU对约20000条同义编码序列排序并选ELF1–ELF3；在EcN中行Western blot定性检测，Ni-NTA富集ELF2；NCM460细胞用CCK-8和ELISA检测。
3.1 结构筛选与选择重设计乳铁蛋白变体：通过ProteinMPNN重设计、SurfSol溶解度排序、AlphaFold 3结构预测及PyMOL结构比较，研究人员从1000个候选变体中筛选。Mut31的SurfSol预测溶解度为0.3604，在RMSD低于0.8 ?且具溶解度数据的候选中有最高预测溶解度；其与野生型乳铁蛋白（WT-LF）的RMSD为0.777 ?、TM-score为0.86，被选为Mut-LF。表面疏水性和离子化图总体相似、重设计区域附近有局部差异；未计算溶剂可及表面积（SASA）等定量表面描述符。结论是Mut-LF兼具较好预测溶解度和高预测结构相似性，但结构相似性仅作为筛选标准，并非保留LF功能的直接证据。
3.2 密码子表达预测模型的性能比较：通过整理公开密码子表达数据集并获得4281条唯一编码序列，研究人员比较六种模型。仅发现两对全长蛋白序列同一性≥70%，最大为72.4%，且均在训练集；无跨训练、验证和测试子集≥70%的序列对，完整数据集中无≥80%的序列对。混淆矩阵显示BiGRU假阳性最低（38），MLP、XGBoost、随机森林、SVM和Transformer分别为52、65、67、70和82；BiGRU假阴性较多。由于下游只能合成和实验评估有限候选，研究强调精确率和假阳性控制；该比较也用于模型选择，可能存在选择诱导的乐观偏差，需独立外部验证。
3.3 ROC和精确率-召回率分析与模型选择：通过ROC和精确率-召回率（PR）曲线评估阈值无关判别能力，BiGRU取得最高ROC-AUC 0.777，高于XGBoost（0.722）、SVM（0.715）、随机森林（0.713）、Transformer（0.693）和MLP（0.677）；其AP为0.720，亦为最高。结论是BiGRU在较宽阈值范围内保持较好的精确率与召回率平衡，并因较高精确率和较低假阳性率更适合下游实验筛选，故被选用于编码序列排序。
3.4 BiGRU引导的密码子优化与实验验证：通过随机同义替换约50%密码子位置并保持编码氨基酸序列，研究人员生成约20000条同义编码序列，用BiGRU评分并选ELF1、ELF2和ELF3；构建C端6×His标签表达构建体，并以常规密码子优化WT-LF参考构建体CO-LF作参考，转入EcN。生长曲线显示各构建体在24 h内生长谱 broadly 相似，未见明显生长抑制。以等量总可溶蛋白行Western blot，ELF2可溶组分出现两条不同迁移率的抗His反应条带，ELF1、ELF3和CO-LF在所用条件下未检测到相应条带；ELF2经Ni-NTA富集后SDS–PAGE显示接近预期分子量的主带及较低强度条带。结论是三个同义序列编码同一Mut-LF但表达谱不同，与同义密码子组成影响异源表达相符；CO-LF编码WT-LF而ELF1–ELF3编码Mut-LF，且未包含常规优化Mut-LF构建体，故不能视为密码子优化策略的直接比较；未测单位培养体积或生物量的可溶产量，需LF特异性免疫检测或质谱鉴定条带。
3.5 ELF2衍生制备物在NCM460细胞中的细胞效应：通过CCK-8确定50 μg/mL用于后续实验（WT-LF和ELF2衍生制备物的相对CCK-8信号分别为91.68±1.67%和83.47±1.62%），并用LPS刺激NCM460细胞、ELISA检测细胞因子。ELF2衍生制备物使IL-6由18.61±0.27 pg/mL降至9.47±0.48 pg/mL，TNF-α由248.40±6.45 pg/mL降至135.81±6.05 pg/mL，并使IL-10由12.91±0.26 pg/mL升至18.29±0.53 pg/mL；两个处理组间无显著差异。结论是该制备物处理与LPS刺激NCM460细胞中较低IL-6和TNF-α及较高IL-10浓度相关，与重组hLF attenuate LPS诱导炎症反应的既往报道一致；但将细胞因子变化归因于Mut-LF需鉴定和纯度评估，内毒素及共纯化宿主物质可能贡献且未测内毒素、未设mock纯化空载体对照；较低CCK-8信号也需考虑，因细胞因子按上清体积测定，细胞数或代谢差异可能影响结果，且CCK-8另孔测定不能回顾性归一化。
讨论与结论部分总结：讨论强调该整合策略支持优先筛选具有可溶表达信号的hLF构建体，BiGRU因精确率导向适合有限候选实验筛选；同时指出选择比较可能带来乐观偏差、可溶产量未定量、抗His条带未鉴定、内毒素和共纯化宿主物质未区分、缺少mock纯化对照等局限。研究结论翻译：本研究开发了一种整合计算-实验策略，结合蛋白质重设计、结构筛选和BiGRU引导的同义密码子优化，以支持在EcN中优先选择具有良好可溶性表达谱的重组hLF构建体。基于ProteinMPNN的重设计随后经SurfSol筛选和结构评价，鉴定出一个重设计乳铁蛋白变体（Mut-LF），其与野生型乳铁蛋白显示高预测结构相似性，RMSD为0.777 ?，TM-score为0.86。在六种评估的预测模型中，BiGRU表现出很适合精确导向筛选目标的性能特征，随后被用于编码序列优先级排序。对三个模型优先候选的定性筛选在ELF2可溶组分中检测到抗His反应条带，支持其被优先用于进一步表征。ELF2衍生Ni-NTA富集制备物在LPS刺激的NCM460细胞中与较低的IL-6和TNF-α以及较高的IL-10浓度相关。需进一步进行蛋白质鉴定和纯度评估，以确认Mut-LF的存在并阐明其对这些细胞反应的贡献。这些发现支持将蛋白质水平重设计与机器学习辅助编码序列优先级排序整合用于本研究所评估的重组乳铁蛋白构建体的可行性。
