部分脱脂花生粉来源花生蛋白水解物（PPH）在模拟胃肠道与血清消化中的血管紧张素I转换酶（ACE）抑制稳定性、二级结构演变及自发性高血压大鼠（SHR）降压潜力

《Foods》：Antihypertensive Potential and Bioavailability of Peanut Protein Hydrolysate Derived from Partially Defatted Peanut Flour

　　

该研究评估了花生蛋白水解物（PPH）在模拟胃肠道（GI）消化和血清消化过程中血管紧张素I转换酶（ACE）抑制活性及二级结构的变化，并采用自发性高血压大鼠（SHR）模型验证PPH的降压潜力。PPH由花生蛋白浓缩物（PPC）经Alcalase广泛水解制备，并分别经模拟胃消化、肠消化及序贯消化处理。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示PPH相对耐受GI消化。较高的单酶浓度和较长的消化时间可提高PPH的ACE抑制活性，而序贯消化未使其发生显著变化。在血清中，PPH的ACE抑制活性至少持续30 min，提示到达循环的PPH肽段在该时段内可能仍保持活性，但至180 min时大部分活性丧失。在SHR中，PPH以1000 mg/kg体重/天的口服剂量可减弱平均动脉压（MAP）的升高，其效果与captopril相当。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表明，序贯消化降低了PPH中相对α-螺旋含量，但增加了β-折叠、β-转角和無规卷曲含量。总体而言，PPH有望作为血压管理的功能性食品或膳食补充剂。对于体重60 kg的高血压成人，每日摄入9.7 g PPH可能有助于控制血压。

研究背景与目的：高血压影响全球超过10亿人，且近48%的美国成人受累；降压药物虽有效，但副作用可限制患者依从性。食物蛋白来源降压肽可作为补充性膳食策略，且不良反应少。其重要机制之一是抑制肾素-血管紧张素系统（RAS），尤其是抑制血管紧张素I转换酶（ACE，一种调节血压的关键酶）和肾素。食物蛋白需水解为2–20个氨基酸的肽段才能释放降压肽；蛋白水解物相较纯化肽具有易消化、可由食品副产物低成本生产、产量高及多生物活性等优势。脱脂花生粕是花生油提取副产物，含34–52%蛋白，全球产量大；花生蛋白富含精氨酸，而精氨酸是一氧化氮（NO）合成前体，NO为重要血管舒张因子。花生蛋白水解物（PPH，花生蛋白经蛋白酶水解得到的肽混合物）已在体外和体内显示ACE抑制活性；Alcalase水解可产生ACE/肾素抑制和抗氧化等多功能肽，并可降低花生粉致敏潜力。然而，PPH在吸收和代谢过程中对胃肠道（GI）消化及血清肽酶的稳定性尚不清楚；短肽二级结构与其ACE抑制活性的关系亦存在争议。因此，该研究评估PPH在模拟GI消化和血清孵育下ACE抑制活性及二级结构变化，并用SHR验证其降压潜力。

研究人员制备花生蛋白浓缩物（PPC）并经Alcalase水解制得PPH，开展模拟胃、肠及序贯消化、人血清孵育、ACE抑制活性测定、FT-IR二级结构分析及SHR灌胃实验。研究结论提示，PPH较PPC具有更强ACE抑制活性，相对耐受GI消化，在血清10–30 min内可保持活性，高剂量可减弱SHR的MAP升高；PPH有望作为血压管理的功能性食品或膳食补充剂，并为脱脂花生粕增值利用提供依据。

关键技术方法：以部分脱脂花生粉制备PPC，经Alcalase水解制备PPH；参照Brodkorb et al. (2019)方案，用模拟胃液和模拟肠液进行胃、肠及序贯消化，并以商业混合正常成人血清进行血清孵育；通过SDS-PAGE、BCA法、茚三酮法分析分子量分布、蛋白/肽含量和游离氨基酸（FAA）；以FAPGG底物法测定ACE抑制活性并计算IC₅₀；用FT-IR解析二级结构；采用48只10周龄雄性SHR（购自Envigo）随机分为6组（n=8），每日灌胃8周并每周以尾套法测MAP。

研究结果：
3.1 模拟GI消化对PPC和PPH分子量分布的影响：SDS-PAGE显示未消化PPC呈多条蛋白带，其中64.74 kDa带可能对应Ara h1，并在所有消化样品中消失；胃蛋白酶对PPH肽带影响很小，胰酶降低PPH上清中7.7 kDa肽带强度但增加沉淀中肽带强度；序贯消化降低两相肽带强度，但未完全消除5.36和6.04 kDa肽，表明Alcalase生成肽段部分耐受GI消化。
3.2 对蛋白/肽含量和FAA释放的影响：BCA法显示PPC经各模拟消化后蛋白/肽含量显著降低，而PPH经单酶消化较稳定，序贯消化后表观含量最高，可能与小肽显色响应较强有关；FAA变化与BCA结果相反，Alcalase水解后PPH的FAA为195 mg/g，远高于PPC的45.58 mg/g；PPH胃消化未增加FAA，序贯消化所致FAA增加也小于PPC，支持PPH相对耐消化。
3.3 对ACE抑制活性的影响：captopril的IC₅₀为5×10^?6 mg/mL，验证了检测条件；未消化PPC活性最弱，PPH活性约为其6倍；PPC消化后IC₅₀降至不足对照的三分之一，序贯消化最低，酶类型影响显著而消化时间不显著；PPH的IC₅₀受酶类型、酶浓度和消化时间影响，胃蛋白酶2 h可降低IC₅₀，但浓度增至2 mg/mL未进一步提高；胰酶浓度和時間具显著主效应；序贯消化虽水解最彻底，却未产生最低IC₅₀，提示新抑制肽释放与既有肽降解之间存在平衡。
3.4 血清孵育对PPH ACE抑制活性的影响：PPH及其模拟消化物在人血清中孵育10、30和180 min；前30 min ACE抑制活性未下降，多数样品10或30 min时显著高于0 min；180 min时所有PPH样品活性显著下降，胃消化样品低于16%，肠消化和序贯消化样品低于10%，而captopril未下降；提示PPH肽在10–30 min循环相关窗口内可能保持活性，但3 h后大部分丧失，且该研究未评估肠道吸收。
3.5 PPH对SHR血压的影响：8周实验中各组前3周MAP均升高；低剂量PPH、盐水和PPC组此后继续升高或维持高位；captopril组第2周后略降；aliskiren组第4周最低后略升；高剂量PPH组第3周后下降，第7周最低并于第8周维持较低。第3–6周captopril、aliskiren和高剂量PPH组MAP显著低于其他组；第7–8周captopril与高剂量PPH组无显著差异且低于aliskiren组。效应呈剂量依赖，1000 mg/kg体重/天的人等效剂量约160 mg/kg体重/天，或60 kg成人约9.7 g/天；PPC组MAP最高甚至高于盐水组，提示Alcalase水解对释放降压组分关键。讨论中提出PNA、IL-6、MCP-1及SHR肠通透性等可能参与解释，但未测肠道吸收，且MAP仅于灌胃后4 h测量，不能区分单次急性效应与重复给药慢性效应。
3.6 对PPC和PPH相对二级结构的影响：FT-IR显示α-螺旋为未消化PPC和PPH的主要二级结构；Alcalase水解增加PPH中β-折叠比例，但α-螺旋仍占主导；PPC经胃或肠消化1 h后α-螺旋下降、β-折叠和β-转角升高，2 h后α-螺旋部分回升；PPH经单酶消化结构变化很小；序贯消化使PPC α-螺旋变化较小、β-折叠和β-转角升高、无规卷曲略降，而使PPH α-螺旋下降、β-折叠、β-转角和無规卷曲升高；PPH各处理1 h与2 h结构相近，提示结构变化主要在首小时发生，β-转角和无规卷曲构象可能更耐受GI酶。
3.7 二级结构与ACE抑制活性的相关性：PPC消化物中β-折叠（r=?0.66）和β-转角（r=?0.78）与IC₅₀负相关，仅β-转角相关显著（p<0.05），β-折叠相关在p<0.10水平显著；α-螺旋和无规卷曲与IC₅₀正相关但不显著。PPH中α-螺旋与IC₅₀呈中度负相关（r=?0.56，p=0.19），β-折叠和β-转角升高与活性降低相关，可能与肽聚集阻碍ACE活性位点有关；短肽可能更多依赖一级序列而非稳定二级结构。该结果与Yu et al. (2011)和Cian et al. (2015)的不一致发现共同提示，二级结构对ACE抑制的作用具有蛋白/肽特异性；后续需用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）肽组学鉴定各消化阶段存留序列。

讨论与结论总结：该研究提示PPH的ACE抑制活性约为PPC的6倍，PPH较PPC更耐受GI消化；单相消化维持或提高其活性，序贯消化无显著改变；血清中10–30 min活性可保持，180 min大部分丧失；SHR中1 g/kg体重/天PPH可减弱MAP升高，而等剂量PPC无效，说明Alcalase水解是释放降压组分的关键；二级结构并非主要决定因素，肽序列、分子量和疏水性更重要。作者提出包埋等保护性递送策略可能有助于提高完整活性肽到达体循环的比例，并指出尚需肽组学鉴定、肠道吸收测定及人体临床试验。

研究结论部分翻译：本研究揭示，由PPC经Alcalase水解制备的PPH，其ACE抑制活性约为PPC的6倍，证实酶解可从花生蛋白释放降压肽。PPH比PPC更耐受胃肠道消化，单相消化维持或提高其ACE抑制活性，而序贯消化未使其发生显著变化，提示尽管消化过程中可能产生一些额外生物活性肽，但PPH的ACE抑制活性可能主要归因于Alcalase生成且对胃肠道降解部分耐受的肽。相关性分析提示，PPH的生物活性更多取决于肽的性质（如序列、分子量和疏水性）而非二级结构。PPH肽在人血清中于10–30 min的生理相关循环窗口内保持ACE抑制活性，因此可能在吸收后仍具活性；至180 min时大部分活性丧失。PPH以1 g/kg体重/天的日剂量减弱SHR的MAP升高，而相同剂量PPC无效，提示需Alcalase水解才能释放花生蛋白的降压组分。能够到达循环的PPH ACE抑制肽可能参与该效应，但未测肠道吸收，该联系尚待证实。可能需要包埋等保护性递送策略，以最大化完整生物活性肽到达体循环的比例。因此，PPH有望作为血压管理的营养保健品或功能性食品配料，同时提高脱脂花生粕这一花生油提取副产物的附加值。仍需进一步研究确定PPH或富含PPH食品的治疗潜力，包括通过肽组学鉴定生物活性肽序列、测定其肠道吸收以及开展人体安全性和有效性临床试验。