《Foods》：Proteolytic Activity and Volatile Compound Formation by Staphylococcus warneri, Rothia uropygioeca, and Enterococcus lactis in Pea Protein Fermentations
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中文摘要翻译：向清洁标签植物基食品的转变推动了天然发酵策略的研究，以期减少不良风味并改善植物蛋白的口感与营养品质。本研究评估了分离自动物源性熟成食品的142株微生物，筛选出4株具有蛋白水解活性的革兰氏阳性球菌（Staphylococcus warneri GC
中文摘要翻译：向清洁标签植物基食品的转变推动了天然发酵策略的研究，以期减少不良风味并改善植物蛋白的口感与营养品质。本研究评估了分离自动物源性熟成食品的142株微生物，筛选出4株具有蛋白水解活性的革兰氏阳性球菌（Staphylococcus warneri GC 13和GC 28、Rothia uropygioeca GC 15及Enterococcus lactis GC 40），用于发酵豌豆分离蛋白（pea protein isolate）和质构化豌豆蛋白（textured pea protein）作为植物基模型底物。在25 °C条件下发酵48 h，微生物学及理化参数均发生显著变化，且变化呈基质依赖性；与豌豆分离蛋白相比，质构化豌豆蛋白支持更高的乳酸菌生长和更强的酸化作用。游离氨基酸谱分析表明蛋白水解活性具有菌株依赖性和基质依赖性，其中GC 13和GC 15在豌豆分离蛋白中促进总游离氨基酸含量最高，而GC 15、GC 28和GC 40在质构化豌豆蛋白中显著增加了多种氨基酸含量。生物胺分析显示酪胺（tyramine）为主要胺类，在接种的质构化豌豆蛋白中含量达162–212 ng/g，未接种对照中达348 ng/g，而豌豆分离蛋白中仅检出痕量水平。挥发性有机化合物分析将化合物分为三个簇，证实了天然豆腥味醛类的减少以及醇类、酮类和酸类的形成，尤其在质构化蛋白中更为显著，表明香气谱发生了实质性重塑。总体而言，研究结果表明所评估的菌株可作为清洁标签工具，用于增强蛋白水解、减弱不良风味并将豌豆蛋白基质中的生物胺维持在可接受水平，其中R. uropygioeca GC 15被认为是植物蛋白发酵中具有应用潜力的候选菌株。
论文解读
一、研究背景与目的
随着消费者对清洁标签（clean label）食品的需求日益增长，食品工业正致力于减少合成添加剂的使用并提高产品透明度。植物基蛋白作为动物蛋白的可持续替代品受到广泛关注，但其应用受到不良风味的显著制约，尤其是豆腥味和苦涩味，这些风味主要来源于脂质氧化产物（如醛类和酮类），严重影响消费者的接受度。传统的风味改善手段多依赖掩蔽剂或合成风味增强剂，与清洁标签理念相悖。微生物发酵被视作一种符合清洁标签原则的生物技术策略，可通过蛋白水解微生物（proteolytic microorganisms）的作用改善植物蛋白的风味和营养品质。然而，目前对于菌株特异性蛋白水解特性、发酵参数的优化以及风味化合物形成机制的解析仍不充分，且多数蛋白水解活性研究是在无菌植物基质中开展，未涉及真实非灭菌植物基质中复杂微生物群落的影响。为此，研究人员从动物源性熟成食品中筛选具有蛋白水解活性的微生物，应用于非灭菌豌豆蛋白基质中，旨在探索一种无需合成添加剂即可改善植物蛋白风味和营养价值的清洁标签发酵策略。
二、研究内容与主要结论
研究人员从西班牙埃斯特雷马杜拉大学食品卫生与安全研究组菌种库中选取142株分离自动物源性熟成制品的微生物（100株细菌和42株酵母），通过蛋白水解琼脂和脂解琼脂筛选，获得4株兼具蛋白水解活性且脂解活性低或不明显的革兰氏阳性球菌，即GC 13、GC 15、GC 28和GC 40。经全基因组测序（whole genomic sequencing, WGS）鉴定，GC 13和GC 28均为Staphylococcus warneri，GC 15为Rothia uropygioeca，GC 40为Enterococcus lactis。将这4株菌分别接种于豌豆分离蛋白和质构化豌豆蛋白（均添加0.05%葡萄糖，最终蛋白浓度为2%）中，于25 °C发酵48 h，系统评估了发酵过程中微生物动态、理化参数、游离氨基酸（free amino acids, FAA）、生物胺（biogenic amines, BA）及挥发性有机化合物（volatile organic compounds, VOCs）的变化。结果表明，4株菌均能在非灭菌豌豆蛋白基质中生长并发挥蛋白水解作用，但效果具有明显的菌株依赖性和基质依赖性。质构化豌豆蛋白较豌豆分离蛋白表现出更强的酸化和更高的乳酸菌生长量，且游离氨基酸积累更为显著。在生物胺安全性方面，酪胺为主要胺类，但含量远低于欧盟食品安全局（EFSA）规定的安全阈值。挥发性化合物分析显示，发酵显著降低了豆腥味醛类（如己醛、戊醛）并促进了醇类、酮类和有机酸的形成，表明香气谱发生实质性重塑。综合各项指标，R. uropygioeca GC 15在游离氨基酸积累、风味改善、微生物生长动力学及生物胺安全性方面表现最优，被认定为最具应用潜力的菌株。该研究证实了筛选的微生物可作为清洁标签工具应用于非灭菌植物蛋白基质，为植物蛋白发酵工艺的优化和工业化应用奠定了基础。
三、关键技术与方法
本研究采用的主要关键技术包括：（1）蛋白水解与脂解活性琼脂筛选法，以豌豆分离蛋白为底物评估菌株的蛋白水解能力并以三油酸甘油酯评估脂解能力；（2）全基因组测序（WGS）技术，基于Oxford Nanopore平台完成基因组组装与物种鉴定，并初步评估抗生素耐药基因和毒力因子；（3）高效液相色谱-高分辨质谱联用（UHPLC-HRMS）技术，用于游离氨基酸（FAA）和生物胺（BA）的定性和定量分析；（4）固相微萃取-气相色谱-质谱联用（SPME-GC-MS）技术，用于挥发性有机化合物（VOCs）的检测与鉴定；（5）统计分析和层次聚类分析，通过Shapiro–Wilk检验、Levene检验、Tukey HSD或Kruskal–Wallis检验进行组间比较，并利用RStudio基于欧氏距离和Ward最小方差法对VOC谱进行层次聚类热图分析。样本队列来源为西班牙埃斯特雷马杜拉大学食品卫生与安全研究组菌种库中分离自动物源性熟成食品的142株微生物。
四、研究结果
（1）微生物筛选与鉴定：在142株微生物中，仅GC 13、GC 15、GC 28和GC 40在72 h内表现出确证的蛋白水解活性，其中GC 13和GC 28在48 h形成水解圈，GC 15和GC 40在72 h形成水解圈。GC 13和GC 28还表现出较低的脂解活性。经WGS鉴定，GC 13和GC 28为S. warneri，GC 15为R. uropygioeca，GC 40为E. lactis。初步基因组分析显示这些菌株不携带主要抗生素耐药基因（vanA/vanB）和主要毒力基因（esp、hyl、asa1、gelE、cylA）。
（2）理化与微生物动态：在两种基质中，接种样品的pH均随发酵时间逐渐下降。豌豆分离蛋白的pH从7.15降至6.37–6.55，而质构化豌豆蛋白的酸化更为显著，pH从7.08降至5.22–5.41。水分活度（aw）在整个发酵期间保持在约0.980，无显著差异。需氧嗜温菌计数在两种基质中均显著增加，但质构化豌豆蛋白支持更高的微生物生长量。乳酸菌（LAB）在质构化豌豆蛋白中大量增殖（第2天达7.33–8.56 log CFU/g），而豌豆分离蛋白中LAB仅在第2天才检出（3.35–4.56 log CFU/g）。R. uropygioeca GC 15和E. lactis GC 40在MSA上的生长量显著高于S. warneri GC 13和GC 28，表现出更强的基质适应性。
（3）游离氨基酸（FAA）：豌豆分离蛋白初始FAA总量较低（7.02 μg/g），发酵后S. warneri GC 13和R. uropygioeca GC 15显著提高总FAA（分别达60.90和38.83 μg/g）。质构化豌豆蛋白初始FAA谱更丰富，R. uropygioeca GC 15、S. warneri GC 28和E. lactis GC 40显著增加了多种FAA含量，其中GC 15和GC 40在第2天与Asp、Arg和Gln水平较高相关。总体而言，质构化豌豆蛋白的Glu、Val、Ile/Leu、Lys、Gln和总FAA含量显著高于豌豆分离蛋白，而Tyr则在豌豆分离蛋白中浓度更高。
（4）生物胺（BA）：豌豆分离蛋白中仅检出酪胺和色胺，总BA含量始终低于1.2 ng/g。质构化豌豆蛋白中酪胺为主要胺类，第2天接种样品中达162–212 ng/g，未接种对照达348 ng/g。总BA含量在质构化豌豆蛋白中显著高于豌豆分离蛋白。接种S. warneri GC 28和E. lactis GC 40的样品及未接种对照中总BA随发酵时间显著增加。所有检测值均远低于EFSA规定的安全阈值（600 mg/餐）。
（5）挥发性有机化合物（VOCs）：VOCs经层次聚类分为三个簇。簇1为原料中固有的醛类（戊醛、己醛、庚醛、苯甲醛、2-辛烯醛、壬醛）及部分醇酮类化合物，在发酵过程中显著下降。例如，豌豆分离蛋白中己醛从第0天的21.7 AU×10?降至第1天接种样品的<1 AU×10?，而未接种对照仍为17.3 AU×10?。簇2为发酵过程中生成的支链醛、高级醇、烃类、酮类和酚类化合物，如1-戊醇、1-己醇、2-己酮和2,4-二(1,1-二甲基乙基)苯酚，在豌豆分离蛋白中积累更为明显。簇3为质构化豌豆蛋白特异性形成的短链酸和含氧酮类，包括乙酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、2,3-丁二酮和3-羟基丁酮，这些化合物在豌豆分离蛋白中几乎未检出，反映了基质效应对代谢途径的显著影响。
五、讨论与结论
讨论部分指出，菌株间蛋白水解能力的差异可能反映蛋白酶基因表达、酶分泌效率和肽酶组成的不同。质构化豌豆蛋白中较高的FAA浓度可能源于挤压加工导致的营养成分多样性和碳水化合物可利用性增强，从而促进微生物代谢和风味形成。LAB在质构化豌豆蛋白中的快速增殖与其碳水化合物代谢能力有关，这解释了该基质中更强的酸化和更高LAB计数。挥发性化合物分析表明，醛类向醇类的转化可能由乙醇脱氢酶活性驱动，而乙偶姻和丁二酮等酮类化合物主要来源于LAB代谢，且受基质组成的显著调控。研究人员强调，R. uropygioeca GC 15在游离氨基酸积累、风味改善和生物胺安全方面表现综合最优，可作为豌豆蛋白发酵的候选起始菌株。同时，WGS分析结果显示菌株不含主要抗生素耐药基因和毒力基因，但其物种尚未列入EFSA资格推定安全（QPS）清单，在工业化应用前仍需进一步全基因组安全性评估和感官验证。
研究结论表明，4株蛋白水解菌（S. warneri GC 13、S. warneri GC 28、R. uropygioeca GC 15和E. lactis GC 40）介导的受控微生物发酵可作为一种清洁标签策略，在控制生物胺产生的同时改善植物蛋白的风味和营养局限性。菌株依赖性游离氨基酸的生成提高了蛋白质品质和生物利用率，同时降解了内源性不良风味醛类。基质依赖性差异揭示了蛋白加工历史对发酵结果的决定性影响，强调了针对特定基质优化起始菌株选择和发酵参数的必要性。从生物技术应用角度看，R. uropygioeca GC 15在游离氨基酸积累、挥发性风味谱和微生物生长动力学方面均表现出优势，同时维持可接受的生物胺安全性。这些发现证明，所选微生物可成功应用于非灭菌植物蛋白底物，有助于开发减少或避免蛋白原料预灭菌的发酵工艺，同时保障过程安全性。在全基因组测序进一步确认4株菌的安全性之前，暂不建议将其直接投入工业应用。
