慢性氧化应激下星形胶质细胞和小胶质细胞年龄相关及脑区特异性形态与分子改变：雄性Wistar大鼠研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Age-Related and Region-Specific Morphological and Molecular Alterations of Astrocytes and Microglia Following Chronic Oxidative Stress in Male Wistar Rats

　　

衰老与慢性促炎背景及对氧化应激和神经退行性过程易感性增加相关。然而，慢性氧化应激下胶质细胞年龄依赖性的形态和分子改变仍未被充分表征。本研究旨在探讨成年（4–6月龄）和老年（22–24月龄）雄性Wistar大鼠在慢性AlCl₃给药（100 mg/kg/天，持续60天）后，海马和内嗅皮层（EntC）中星形胶质细胞和小胶质细胞的年龄及区域特异性改变。采用Morris水迷宫评估空间学习与记忆能力。通过免疫组织化学和形态计量学评估GFAP⁺星形胶质细胞和Iba1⁺小胶质细胞。分别采用ELISA和Western blotting检测海马4-HNE和pTau（Ser404）。通过RT-qPCR评估海马Tnf、Tgfb、Mmp9、Bdnf、Ntrk2和Gpx4的表达，同时采用ELISA检测血清MMP-9和HSP-70浓度。衰老与两个脑区胶质细胞体积增大、海马Tnf表达升高、Tgfb和Ntrk2表达降低以及血清MMP-9和HSP-70浓度升高相关。在成年大鼠中，AlCl₃暴露伴随星形胶质细胞形态改变和EntC中Iba1⁺细胞密度增加，而海马中的分子代偿机制得以保留。仅老年AlCl₃处理大鼠在Morris水迷宫中发现原有平台位置的成功率降低，且海马4-HNE水平显著升高，与脂质过氧化增强一致。尽管海马pTau（Ser404）免疫反应性呈年龄相关增加，但未检测到AlCl₃暴露或年龄+AlCl₃的统计学显著效应。在该组中，AlCl₃暴露与两个脑区Iba1⁺细胞密度增加、海马星形胶质细胞肥大形态以及EntC中星形胶质细胞面积减少伴突起碎片化相关。这些变化与海马Bdnf和Gpx4表达降低以及血清MMP-9和HSP-70浓度降低共存。总体而言，这些发现表明衰老影响慢性AlCl₃诱导氧化应激下区域特异性胶质细胞形态改变及相关分子反应。该模型展示了一种转化研究方法，可为年龄相关神经退行性变的机制提供见解。

衰老伴随着慢性低度促炎背景和氧化应激易感性增加，是神经退行性疾病的重要风险因素。然而，以往针对慢性氧化应激下胶质细胞变化的研究多集中于成年动物，且缺乏脑区比较，老年动物中星形胶质细胞和小胶质细胞的年龄依赖性形态及分子改变尚未充分阐明。常规品系大鼠虽不会自然发生人类特异性年龄相关疾病，但可通过慢性氧化应激刺激模拟病理条件。为此，研究人员采用慢性AlCl₃诱导氧化应激模型，系统比较了成年和老年雄性Wistar大鼠海马与内嗅皮层（EntC）中胶质细胞的变化，并结合行为学、形态学及分子标志物检测，旨在揭示年龄和脑区特异性的胶质反应模式，为年龄相关神经退行性变的机制研究和转化建模提供依据。

研究人员将成年（4–6月龄）和老年（22–24月龄）雄性Wistar大鼠各分为对照组和AlCl₃处理组（100 mg/kg/天，饮水给药60天），每组10只。采用Morris水迷宫评估空间学习记忆；通过免疫组织化学和形态计量分析GFAP⁺星形胶质细胞与Iba1⁺小胶质细胞的密度和面积；ELISA检测海马4-HNE及血清MMP-9、HSP-70；Western blot检测海马pTau（Ser404）；RT-qPCR检测海马Tnf、Tgfb、Mmp9、Bdnf、Ntrk2和Gpx4表达。行为学每组10只，组织学和分子检测每组5只。动物来源为俄罗斯科学院生物化学研究所普希诺分所实验动物饲养设施。

结果方面：

**2.1 衰老和氧化应激引起的行为变化**
Morris水迷宫训练中，各组大鼠均能学会定位平台，但在撤除平台7天后的探测试验中，老年AlCl₃处理组仅40%成功穿越原平台位置，显著低于成年处理组（100%）和老年对照组（90%），Kaplan–Meier分析显示老年处理组首次穿越潜伏期显著延长，提示长期空间记忆保持或提取能力受损。

**2.2 氧化应激改变4-HNE和pTau水平**
ELISA显示，与老年对照组相比，老年AlCl₃处理组海马4-HNE浓度显著升高，表明脂质过氧化增强。Western blot显示pTau（Ser404）存在年龄相关差异（老年处理组高于成年处理组），但未检测到AlCl₃处理或年龄×处理交互的显著效应。

**2.3 衰老和氧化应激区域特异性改变小胶质细胞和星形胶质细胞形态与数量**
免疫组化和形态计量显示，衰老本身导致海马和EntC中Iba1⁺小胶质细胞面积增大，而密度不变。成年AlCl₃处理组仅在EntC出现Iba1⁺细胞密度增加（较对照升高2.5倍），海马未见显著变化。老年AlCl₃处理组两个脑区Iba1⁺密度均显著增加（海马较老年对照组升高2.3倍，EntC升高2.8倍），同时细胞面积较成年处理组增大。GFAP⁺星形胶质细胞方面，成年处理组主要表现为突起过度分支而细胞大小不变；老年对照组星形胶质细胞增大；老年处理组海马星形胶质细胞呈肥大伴高度分支，而EntC中细胞面积较老年对照组和成年处理组显著减小（从113.5 μm²降至77.3 μm²），突起变细并碎片化，呈现区域特异性萎缩样改变。

**2.4 海马炎症和神经保护标志物表达差异改变**
RT-qPCR显示，衰老导致海马促炎因子Tnf表达升高，抗炎因子Tgfb和神经营养受体Ntrk2表达降低。成年AlCl₃处理组Mmp9表达较成年对照组升高，而老年处理组Mmp9未升高且显著低于成年处理组。老年AlCl₃处理组Bdnf和Gpx4表达显著低于老年对照组，且Gpx4也显著低于成年处理组，提示神经营养支持下降和抗氧化防御能力减弱。

**2.5 血清炎症和应激反应标志物与胶质改变相关**
ELISA显示，与成年对照组相比，老年对照组血清MMP-9和HSP-70均显著升高，提示与衰老相关的全身性促炎和应激反应背景。成年AlCl₃处理组血清HSP-70显著高于成年对照组，但老年AlCl₃处理组血清MMP-9和HSP-70均显著低于老年对照组，表明老年动物在慢性氧化应激下全身适应性储备耗竭。

讨论部分指出，常规大鼠不发展人类特异性年龄相关疾病，而慢性AlCl₃诱导的氧化应激可在老年动物中模拟类似年龄相关神经退行性变的胶质形态和分子特征。老年处理组海马星形胶质细胞肥大和EntC星形胶质细胞萎缩的区域差异，与BDNF/TrkB信号下降及Gpx4介导的抗氧化能力降低相伴随，提示胶质支持功能受损可能是神经退行性变的重要环节。血清标志物变化与脑内胶质改变并非直接因果关系，但反映了全身适应性反应与脑内病理状态的共存。

研究人员得出的结论是：本探索性研究表明，在雄性Wistar大鼠中，衰老与慢性AlCl₃暴露下区域特异性的形态和分子反应相关。衰老伴随海马和EntC中Iba1⁺小胶质细胞和GFAP⁺星形胶质细胞面积增大，海马Tnf表达升高、Tgfb和Ntrk2表达降低，同时存在循环MMP-9和HSP-70的年龄相关差异。慢性AlCl₃暴露根据年龄和脑区引起不同的胶质形态改变：成年大鼠主要涉及EntC中Iba1⁺细胞密度增加和星形胶质细胞形态改变；老年大鼠表现为两个脑区Iba1⁺密度增加、GFAP⁺形态改变以及EntC星形胶质细胞面积减小，而海马GFAP⁺密度无显著增加。老年AlCl₃处理大鼠在Morris水迷宫探测试验中定位原平台位置的成功率降低，海马4-HNE水平升高，同时伴有Bdnf和Gpx4表达降低。尽管观察到海马pTau（Ser404）免疫反应性的年龄相关差异，但未检测到AlCl₃处理或年龄×处理的显著效应。总体而言，这些发现确定了慢性氧化应激下胶质形态改变和分子反应的年龄及区域依赖性模式，为研究衰老、氧化应激、胶质反应与神经退行性变之间的关系提供了基础，但仍需进一步的功能和神经病理学研究来确证潜在机制及其与AD转化建模的相关性。