毛毡杜鹃枝提取物通过部分恢复Akt/mTOR信号通路与促进FoxO3α磷酸化改善地塞米松诱导的C57BL/6小鼠肌肉萎缩

《International Journal of Molecular Sciences》：Effects of Rhododendron mucronulatum Branch Extract on Dexamethasone-Induced Muscle Loss and Muscle Atrophy in C57BL/6 Mice

　　

研究人员研究了毛毡杜鹃（*Rhododendron mucronulatum*）枝提取物（RMB）对地塞米松（DEX）诱导的年轻成年雄性C57BL/6小鼠肌肉萎缩的影响。小鼠口服RMB（100、200或400 mg/kg）4周，并在最后2周腹腔注射DEX（5 mg/kg）。RMB在200和400 mg/kg剂量下显著改善了运动时间和运动能力（400 mg/kg对比DEX对照组：力竭时间，29.5对比21.3 min），握力呈增加趋势。在所有剂量下，肌纤维横截面积和腓肠肌重量均得以保持。RMB在200 mg/kg剂量下提高了磷酸化Akt/Akt比值，在400 mg/kg剂量下提高了磷酸化mTOR/mTOR比值，并在所有剂量下提高了磷酸化FoxO3α/FoxO3α比值。Atrogin-1在所有剂量下均被抑制，MuRF1在400 mg/kg剂量下被抑制，而MyoD和Myogenin在400 mg/kg剂量下增加，IGF-1在200和400 mg/kg剂量下增加。RMB还降低了肌内TNF-α和IL-6，恢复了肌肉和血清中的抗氧化防御能力，并增加了Bcl-2。这些发现表明，RMB主要通过部分恢复Akt/mTOR信号通路、促进FoxO3α磷酸化以及抑制Atrogin-1和MuRF1来改善DEX诱导的肌肉萎缩，并伴随额外的抗炎、抗氧化和抗凋亡作用。

**骨骼肌萎缩的研究背景与RMB的干预潜力**

骨骼肌不仅是运动器官，还通过分泌肌因子与其他器官沟通，这种肌肉-器官串扰与慢性疾病（如牙周病和阿尔茨海默病）相关，并调节全身代谢，包括葡萄糖稳态、胰岛素敏感性和体温调节。肌肉减少症是与年龄相关的渐进性骨骼肌质量和力量丧失，损害活动能力，增加骨折风险，并降低日常生活能力。肌肉丢失源于蛋白质合成与降解失衡，同时伴有慢性炎症、激素变化、神经肌肉接头损伤和线粒体功能障碍。过量的活性氧（ROS）和减弱的抗氧化防御促进肌纤维氧化损伤和凋亡，表现为B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）/Bcl-2相关X蛋白（Bax）比值降低。此外，通过胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、蛋白激酶B（Akt）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的合成代谢信号受到抑制，而叉头框蛋白O3α（FoxO3α）促进肌肉特异性E3泛素连接酶Atrogin-1和肌肉环指蛋白-1（MuRF1）的表达。抗阻运动和蛋白质补充是一线干预措施，但并非总是有效。植物来源的多酚被报道能减轻骨骼肌中的炎症和氧化应激，调节蛋白质降解途径并支持线粒体功能。毛毡杜鹃是韩国本土灌木，含有多种多酚和黄酮类化合物，其枝提取物（RMB）中的标志性化合物为taxifolin-3-O-arabinopyranoside（Tax-G）。研究人员此前在体外证明RMB、Tax-G和taxifolin通过调节Akt/mTOR/FoxO3α信号通路和凋亡相关蛋白保护C2C12肌管免受地塞米松（DEX）和H₂O₂诱导的损伤，但细胞研究无法确定口服RMB能否在整体水平上保持肌肉质量、力量和耐力。因此，本研究旨在确定口服RMB（100–400 mg/kg）是否能减轻年轻成年雄性C57BL/6小鼠DEX诱导的肌肉萎缩。

研究人员开展了为期4周的动物实验，将小鼠分为正常对照组（G1）、DEX对照组（G2）以及DEX+RMB 100、200、400 mg/kg组（G3–G5），在最后2周腹腔注射DEX（5 mg/kg）诱导肌肉萎缩。研究评估了运动表现、握力、身体成分、肌肉重量和肌纤维横截面积，并通过Western blot和实时PCR分析信号通路和基因表达，同时检测血清抗氧化状态。结果显示，RMB在200和400 mg/kg剂量下显著延长力竭时间并提高运动能力，握力呈增加趋势。RMB在所有剂量下均保持了腓肠肌重量和肌纤维横截面积。分子层面，RMB在200 mg/kg时提高磷酸化Akt/Akt比值，在400 mg/kg时提高磷酸化mTOR/mTOR比值，并在所有剂量下恢复磷酸化FoxO3α/FoxO3α比值。Atrogin-1在所有剂量下被抑制，MuRF1在400 mg/kg时被抑制，而MyoD、Myogenin和IGF-1在较高剂量下增加。此外，RMB降低肌内肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）的mRNA表达，恢复肌肉和血清中的抗氧化防御，并增加抗凋亡蛋白Bcl-2。这项研究首次在体内证实了RMB对DEX诱导肌肉萎缩的多靶点保护作用，为开发针对肌肉减少症的功能性食品原料提供了临床前证据。

**主要技术方法**

研究人员使用8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠（购自Dooyeol Biotech Co., Ltd.，首尔，韩国），随机分为5组（n=10/组）。RMB由Danjoungbio Co., Ltd.（原州，韩国）在GMP条件下生产，经高效液相色谱（HPLC）定量标志物Tax-G。DEX（5 mg/kg）腹腔注射诱导萎缩。使用小动物 treadmill测试力竭时间和运动能力（按Brooks和White公式计算），使用握力计测量前肢握力，使用双能X射线吸收测定法（DEXA）测量体脂和瘦体重百分比。肌肉组织采集后，对胫骨前肌（TA）进行苏木精-伊红（H&E）染色测量肌纤维横截面积（CSA），对腓肠肌（GA）进行Western blot检测Akt、mTOR、FoxO3α及其磷酸化形式以及Bcl-2、Bax蛋白水平，对比目鱼肌（SOL）进行实时PCR检测肌肉形成（MyoD、Myogenin、IGF-1）、萎缩（Myostatin、Atrogin-1、MuRF1）、炎症（IL-1β、IL-6、TNF-α）和抗氧化（SOD2、过氧化氢酶、GPx1）基因表达。血清用于检测谷胱甘肽含量和超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性。

**研究结果**

**2.1 对实验动物体重的影响**：DEX对照组（G2）从第3周起体重显著低于正常对照组（G1），RMB处理组（G3–G5）与G2之间无显著差异，表明RMB对总体重无恢复作用，其益处集中于肌肉相关指标。

**2.2 对运动时间和运动能力的影响**：与G1相比，G2力竭时间（21.3±1.0 min）和运动能力（826.4±59.7 J）显著降低。RMB 200 mg/kg（G4）和400 mg/kg（G5）组均显著提高力竭时间（27.7±0.5 min和29.5±0.6 min）和运动能力（1176.6±31.2 J和1310.8±49.7 J）。

**2.3 对握力的影响**：G2握力（106.7±5.9 g）显著低于G1（165.2±5.9 g），RMB 200和400 mg/kg组握力呈增加趋势（127.2±5.5 g和128.4±7.3 g），但未达统计学显著。

**2.4 对脂肪百分比和瘦体重百分比的影响**：DEX显著增加体脂百分比（G1: 18.1±0.5%，G2: 21.8±0.5%）并降低瘦体重百分比（G1: 81.9±0.5%，G2: 78.2±0.5%），RMB呈剂量依赖性逆转趋势。

**2.5 对肌肉重量的影响**：DEX显著降低腓肠肌（GA）和趾长伸肌（EDL）的绝对重量。与G2相比，所有RMB处理组的GA绝对重量均显著增加，表明GA对DEX诱导的萎缩尤为敏感，而RMB对GA的保护作用最为明显。

**2.6 对胫骨前肌肌纤维横截面积的影响**：H&E染色显示G2肌纤维明显小于G1，而RMB处理组肌纤维较大。定量分析表明，G2的CSA（2345±77 a.u.）显著低于G1（3816±182 a.u.），所有RMB处理组的CSA均显著高于G2。

**2.7 对腓肠肌蛋白水平的影响**：DEX降低磷酸化Akt水平，RMB 200 mg/kg显著提高p-Akt/Akt比值。DEX显著降低磷酸化mTOR水平和p-mTOR/mTOR比值，RMB 400 mg/kg显著恢复该比值。DEX降低磷酸化FoxO3α并增加总FoxO3α水平，所有RMB剂量均显著提高p-FoxO3α/FoxO3α比值。DEX降低Bcl-2水平，RMB 400 mg/kg显著恢复Bcl-2，Bax水平各组无显著差异。

**2.8 对比目鱼肌mRNA表达的影响**：DEX显著降低MyoD、Myogenin和IGF-1 mRNA表达，RMB 400 mg/kg显著恢复MyoD和Myogenin，200和400 mg/kg显著恢复IGF-1。DEX显著增加Myostatin、Atrogin-1和MuRF1表达，Atrogin-1在所有RMB剂量下均被显著抑制，MuRF1在400 mg/kg时被显著抑制，Myostatin呈剂量依赖性降低趋势。炎症基因方面，DEX显著增加IL-1β、IL-6和TNF-α表达，RMB 400 mg/kg显著降低IL-6，200和400 mg/kg显著降低TNF-α。抗氧化基因方面，DEX显著降低SOD2、过氧化氢酶和GPx1表达，RMB 200和400 mg/kg显著恢复SOD2和GPx1，400 mg/kg显著恢复过氧化氢酶。

**2.9 对血清谷胱甘肽含量和抗氧化酶活性的影响**：DEX显著降低血清谷胱甘肽水平以及SOD和GPx活性。RMB 100和200 mg/kg显著增加谷胱甘肽含量，所有RMB剂量均显著恢复SOD和GPx活性，过氧化氢酶活性呈增加趋势。

**讨论与结论总结**

讨论部分指出，RMB改善运动表现与既往DEX模型中Akt/mTOR信号恢复的研究一致。肌纤维CSA和GA重量在100 mg/kg时即显著恢复，而握力仅有恢复趋势，提示结构恢复可能先于功能恢复。不同肌肉对DEX的敏感性不同，GA和EDL（快肌为主）较SOL（慢肌为主）更易受影响。RMB恢复Akt/mTOR/FoxO3α轴是关键分子机制：p-FoxO3α/FoxO3α比值在所有剂量下均恢复，与其靶基因Atrogin-1（所有剂量）和MuRF1（400 mg/kg）的下调一致。RMB还降低肌内TNF-α和IL-6，恢复肌肉和血清抗氧化防御，并上调Bcl-2。部分指标未呈清晰剂量依赖性，可能与不同肌肉的差异性反应、黄酮苷（如Tax-G）肠道吸收饱和以及多酚在中高剂量时的效应平台有关。RMB在GLP毒理学试验中未见不良反应。研究局限性包括：DEX模型属于糖皮质激素诱导的继发性肌肉萎缩而非原发性年龄相关肌少症；仅使用雄性小鼠以避免雌激素周期变异；未直接评估自噬、线粒体功能和肌纤维类型转换；人体疗效需临床试验验证。

研究结论：口服RMB显著减轻了DEX诱导的年轻成年雄性C57BL/6小鼠肌肉萎缩。RMB改善了运动表现；保持了肌纤维横截面积和腓肠肌重量；部分恢复Akt/mTOR信号通路并增加FoxO3α磷酸化；抑制了肌肉分解调节因子Atrogin-1和MuRF1；增强了包括MyoD、Myogenin和IGF-1在内的生肌和合成代谢标志物。RMB还减弱了肌内炎症信号并恢复抗氧化防御，同时Bcl-2的增加与抗凋亡状态的转变一致。机制上，RMB主要通过部分恢复Akt/mTOR信号通路和增加FoxO3α磷酸化来保持骨骼肌结构和功能，伴随Atrogin-1和MuRF1的下调以及IGF-1、MyoD和Myogenin的上调，同时减弱炎症信号、增强抗氧化防御并减弱促凋亡信号。Tax-G是RMB的主要标志性黄酮，可能基于其已知生物学特性和既往体外研究结果对这些多靶点效应有所贡献，但其体内因果作用有待使用分离化合物进行研究。本系统评估为RMB作为功能性原料的监管科学开发提供了临床前证据，支持其在预防或管理肌肉萎缩和年龄相关肌肉丢失方面的进一步研究。