《International Journal of Molecular Sciences》：Heat-Killed Ligilactobacillus salivarius FFIG56 Modulates Innate Immune Response in Bovine Mammary Epithelial Cells
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具有免疫调节作用的乳酸菌（免疫益生菌，immunobiotics）已被提出可通过增强宿主免疫应答来预防牛乳腺炎。此外，越来越多的证据表明，非活菌形式的免疫益生菌（后生元，postimmunobiotics）在调节牛宿主免疫方面可与活菌同样有效。然而，热灭活乳酸
具有免疫调节作用的乳酸菌（免疫益生菌，immunobiotics）已被提出可通过增强宿主免疫应答来预防牛乳腺炎。此外，越来越多的证据表明，非活菌形式的免疫益生菌（后生元，postimmunobiotics）在调节牛宿主免疫方面可与活菌同样有效。然而，热灭活乳酸菌在牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells, BMECs）中发挥免疫调节作用的分子机制仍未完全阐明。本研究评估了热灭活唾液乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）FFIG56（hk-FFIG56）对牛乳腺上皮细胞中Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）介导的先天免疫应答的影响。研究人员将BMECs预先用hk-FFIG56刺激，随后用大肠杆菌（Escherichia coli）来源的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）进行攻击。转录组学分析显示，与仅用LPS刺激的细胞相比，经hk-FFIG56预处理的BMECs中有743个基因上调、881个基因下调，表明LPS诱导的转录应答发生了显著变化。在所评估的炎症介质中，与相应时间点仅用LPS攻击的细胞相比，hk-FFIG56预处理在12小时显著降低了LPS诱导的IL-6和IL-8表达，并在6小时和12小时降低了CCL2表达。在经hk-FFIG56预处理的BMECs中还检测到TLR信号负调控因子IRAK-M、Tollip和MKP-1的差异调控。此外，hk-FFIG56预处理阻止了LPS诱导的IκBα蛋白水平降低，而在所评估的时间点未检测到p-ERK/ERK比值的显著变化。进一步地，hk-FFIG56预处理减弱了LPS诱导的BMECs中CSN3（κ-酪蛋白）mRNA表达的降低。总体而言，这些结果表明hk-FFIG56可调节BMECs中LPS诱导的炎症应答及CSN3 mRNA表达，支持其作为后生元候选菌株在牛乳腺炎预防背景下进一步研究的潜力。
论文解读
一、研究背景与科学问题
牛乳腺炎是全球奶牛养殖业中最常见的疾病之一，对动物健康、福利及乳品生产造成重大经济损失。细菌是乳腺炎的主要病原体，其中大肠杆菌（Escherichia coli）是导致细菌性乳腺炎的主要病原之一。大肠杆菌的致病性由多种毒力因子介导，而脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）作为其主要毒力决定因素，作为微生物相关分子模式（microbe-associated molecular pattern, MAMP）通过Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）激活先天免疫信号，从而促进乳腺炎相关的炎症反应。
目前抗生素仍是牛乳腺炎治疗和控制的重要手段，但治疗效果因病原体、感染严重程度和病程等因素而异。此外，抗生素的广泛及预防性使用引发了抗菌耐药病原体的选择与传播问题，对动物和公共健康构成日益严重的威胁。抗生素在泌乳奶牛中的使用还可能导致牛奶中药物残留，需要休药期，造成经济损失并面临日益增加的监管压力。因此，开发增强宿主自然防御机制的替代或补充策略已成为可持续乳品生产系统中改善乳腺炎控制的重要目标。
益生性乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）已被提出作为预防和治疗牛乳腺炎的有前景的生物技术策略。具有通过调节免疫应答对宿主产生有益作用的益生菌被称为免疫益生菌（immunobiotics）。越来越多的证据表明，某些非活菌免疫益生菌制剂（后生元，postimmunobiotics）可保留与活菌相当的免疫调节活性。然而，热灭活细菌的免疫调节功效不能在不同LAB菌株或实验条件下普遍化，非活菌制剂的效果取决于菌株特异性特征、灭活程序以及细菌组分的组成和结构完整性。因此，有必要针对特定hk-LAB制剂逐一表征其免疫调节特性。
乳腺上皮在细菌感染的先天免疫应答中发挥重要作用。LPS通过TLR4识别激活包括NF-κB和MAPKs在内的细胞内信号通路，调控参与宿主防御的炎性细胞因子和趋化因子的表达。这些应答也受到TLR信号负调控因子的调控，以维持免疫稳态。因此，用hk-LAB预处理乳腺上皮细胞后进行LPS刺激，为研究细菌制剂能否改变后续炎症应答提供了实验途径。尽管已有研究证明了活菌和hk-LAB在牛乳腺中的免疫调节潜力，但关于非活菌制剂对乳腺上皮先天免疫的菌株特异性效应仍存在重要问题，特别是hk-LAB在多大程度上改变BMECs对LPS刺激的全局转录应答、差异调控炎症介质和TLR信号负调控因子、以及影响NF-κB和MAPK相关信号通路，仍有待进一步表征。因此，本研究旨在筛选能够调节BMECs中LPS诱导炎症应答的hk-LAB菌株，并表征所选菌株唾液乳杆菌（Ligilactobacillus salivarius）FFIG56的免疫调节活性。
二、主要关键技术方法
本研究使用了来自日本东北大学农学研究科动物食品功能实验室菌种保藏库的46株乳酸菌。所有菌株在MRS肉汤中37°C培养16小时后，经70°C加热灭活90分钟，重悬于PBS中备用。实验采用此前从荷斯坦奶牛妊娠200天时的乳腺组织建立的牛乳腺上皮细胞系（BMEC），使用第22至28代细胞。研究人员将BMECs接种于24孔板培养至融合后，加入热灭活LAB（2.5 × 10?细胞/孔）预处理12小时，随后用大肠杆菌O55来源的LPS（1.0 μg/mL）刺激。RNA测序分析使用LPS刺激后12小时收集的样本，RT-qPCR和Western blot分析在LPS刺激后3、6和12小时收集样本。RNA-seq数据分析使用STAR比对到牛参考基因组（ARS-UCD1.2），DESeq2进行差异表达分析（|log?FC| > 1，调整后p < 0.05），PANTHER进行GO功能注释。RT-qPCR使用SYBR Green法，以β-actin为内参基因。Western blot检测IκBα、p-ERK/ERK等信号通路蛋白。对于κ-酪蛋白（CSN3）和乳铁蛋白（LTF）表达分析，BMECs在分化培养基中培养7天后再进行hk-FFIG56预处理和LPS刺激。
三、研究结果
3.1 筛选具有降低BMECs中LPS诱导炎症能力的灭活乳酸杆菌
研究人员首先以IL-8（CXCL8）和CCL2（MCP-1）基因表达为生物标志物，对46株hk-LAB进行筛选。二维散点图显示不同hk-LAB对BMECs中这两种炎症趋化因子表达产生了不同的调节效应，凸显了菌株特异性。其中，热灭活唾液乳杆菌FFIG56（hk-FFIG56）因其能够同时降低LPS刺激后两种趋化因子的表达而被选中进行进一步表征。
3.2 hk-FFIG56降低BMECs中LPS诱导的炎症反应
RNA测序分析显示，在LPS、hk-FFIG56和hk-FFIG56+LPS三个处理组中，相对于未处理对照组共鉴定出1128个上调和1358个下调基因。在hk-FFIG56+LPS与LPS处理组的直接比较中，743个基因上调和881个基因下调。Venn图分析显示三个处理组共享266个上调和499个下调基因。热图分析显示hk-FFIG56处理组与LPS刺激组（无论是否经灭活乳杆菌预处理）之间存在明显差异。LPS刺激在对照组和hk-FFIG56处理组BMECs中均诱导多种炎症基因表达增加，但经灭活乳杆菌处理的细胞炎症因子水平显著低于对照组。LPS组与hk-FFIG56+LPS组的倍数变化比较显示IL-1α（15.3 vs. 9.1）、IL-1β（10.1 vs. 8.5）、CXCL8（10.4 vs. 8.1）、CR1（7.7 vs. 2.1）、CCL2（5.5 vs. 4.2）、IL-6（2.5 vs. 1.4）和C4A（2.3 vs. 1.6）等存在差异。RT-qPCR验证实验表明，hk-FFIG56预处理在12小时显著降低了IL-6和IL-8的表达，在6小时和12小时显著降低了CCL2的表达，而CXCL2和CXCL3在各时间点均无显著差异。
3.3 hk-FFIG56对BMECs中TLR信号负调控因子的调节
在无LPS刺激条件下，hk-FFIG56处理在3小时显著降低SIGIRR表达，在12小时增加IRAK-M表达，而对ABIN-3、BCL-3、Tollip和MKP-1无显著影响。在LPS刺激条件下，LPS攻击降低了SIGIRR和Tollip的表达，而hk-FFIG56预处理的BMECs中IRAK-M、Tollip和MKP-1的水平高于仅LPS攻击的对照组细胞。
3.4 hk-FFIG56对BMECs中NF-κB信号通路的调节
Western blot分析显示，LPS刺激在3小时和6小时诱导对照组BMECs中IκBα/β-actin比值降低，与NF-κB信号激活一致。相比之下，hk-FFIG56预处理减弱了LPS诱导的IκBα/β-actin比值降低，在相应时间点显著高于仅LPS刺激的细胞。另一方面，对照组和hk-FFIG56处理组BMECs的p-ERK/ERK比值均未检测到显著变化。
3.5 hk-FFIG56对BMECs中κ-酪蛋白表达的调节
在分化培养基中培养的BMECs从第8天到第12天CSN3表达显著高于标准培养基中的细胞。在后续实验中，BMECs在分化培养基中培养7天，经hk-FFIG56预处理12小时后再进行LPS刺激12小时。结果显示，与仅LPS攻击的对照组BMECs相比，hk-FFIG56显著增加了CSN3表达，而LTF无显著变化。
四、讨论与结论总结
讨论部分
乳腺上皮细胞通过产生细胞因子、趋化因子、干扰素和抗菌肽在乳腺先天免疫中发挥核心作用。本研究结果与先前观察一致，LPS刺激在6小时显著上调BMECs中IL-6、IL-8、CCL2、CXCL2和CXCL3的表达，并维持至12小时。hk-FFIG56预处理显著改变了LPS诱导的转录应答，表明该后生元处理可调节上皮先天免疫信号。与使用活菌的研究相比，本研究证明非活菌FFIG56能够差异调节BMECs中免疫因子的表达以响应TLR4信号激活。hk-FFIG56降低了IL-6、IL-8和CCL2的表达，并阻止了LPS诱导的IκBα蛋白水平降低，提示其对NF-κB相关信号的影响，而p-ERK/ERK比值无显著变化。hk-FFIG56预处理增加了LPS刺激后IRAK-M、Tollip和MKP-1的表达水平，提示该后生元可能通过调节内源性调控机制来调节炎症应答。与先前使用植物乳杆菌CRL2074的研究相比（该研究显示SIGIRR和ABIN-3上调），本研究的差异表明免疫益生菌/后生元对TLR信号通路内负反馈机制的调节具有高度菌株依赖性。值得注意的是，hk-FFIG56预处理并未均匀影响所有LPS诱导的炎症基因，IL-6、IL-8和CCL2显著降低而CXCL2和CXCL3无显著变化，提示可能存在选择性调控机制。研究人员也指出，炎症介质表达的降低不应必然被解释为对乳腺宿主防御的有益效应，IL-8和CCL2对感染期间免疫细胞募集至关重要，过度或持续的炎症可能导致乳腺组织损伤，但炎症应答不足可能损害免疫细胞募集和病原体清除。关于κ-酪蛋白，LPS刺激降低了CSN3 mRNA水平而增加了LTF表达，hk-FFIG56预处理减弱了LPS诱导的CSN3变化，但这些转录变化不一定反映蛋白质丰度、乳品质或乳腺分泌功能的变化。
结论部分
综上所述，本研究证明热灭活唾液乳杆菌FFIG56（hk-FFIG56）可调节牛乳腺上皮细胞中LPS诱导的炎症应答。这些效应与TLR信号负调控因子表达增加及IκBα蛋白水平变化相关，提示NF-κB相关调控机制的潜在参与。此外，hk-FFIG56预处理减弱了分化牛乳腺上皮细胞中LPS诱导的CSN3 mRNA表达降低，但其对κ-酪蛋白蛋白丰度和产奶量的影响仍有待确定。综合来看，这些发现为hk-FFIG56在所评估实验条件下的免疫调节活性提供了证据，并支持对其生物学特性的进一步研究。需要进一步的机制研究和体内评估来确定这些效应是否能转化为对牛乳腺健康的有益结果。
