基于SCOBY发酵的红白鹅莓汁理化、酚类与挥发性重塑及其抗氧化、酶抑制、HepG2细胞生长抑制和感官特性的基质与碳源依赖性研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Cocoa Pulp Juice as a Fermentation Substrate for Potential Probiotic Lacticaseibacillus paracasei WU2502: Genomic Characterization, Metabolite Profiling, and Antimicrobial Activity Against Foodborne Pathogens

　　

共生菌酵母发酵（SCOBY）可改变果汁基饮料的植物化学组成与生物学特性，但此类变化可能因发酵基质而异。本研究考察了采用共生菌酵母发酵剂（SCOBY）进行为期10天的红茶菌发酵对补充蔗糖或荞麦蜂蜜的红、白鹅莓（Ribes uva-crispa）汁的影响。评估了理化特性、酚类与挥发性成分谱、抗氧化能力、酶抑制活性、HepG2细胞生长、基因表达及感官接受度。发酵降低了糖浓度并提高了有机酸与乙醇含量。包括表没食子儿茶素与表没食子儿茶素没食子酸酯在内的若干黄烷-3-醇浓度升高，而部分寡聚原花青素降低。红鹅莓饮料的挥发性成分谱以酯类贡献较大为特征，而白鹅莓饮料中已鉴定挥发性化合物以醇类占优。红鹅莓配方通常表现出更高的酚类浓度与抗氧化能力，其中蜂蜜补充变体数值尤高。然而，从发酵白鹅莓饮料中分离的富酚提取物对HepG2细胞生长的抑制作用强于红鹅莓饮料提取物。白鹅莓提取物还改变了与代谢及癌症相关信号传导有关的若干基因的表达。感官评价表明，蔗糖补充的红鹅莓汁总体接受度最高。上述结果表明，红茶菌发酵的效应取决于鹅莓汁类型与碳源，且酚类丰度与抗氧化能力并不必然预测细胞生长抑制效应或感官接受度。

本研究以红、白鹅莓（Ribes uva-crispa）汁为基质，分别补充蔗糖或荞麦蜂蜜，采用共生菌酵母发酵剂（symbiotic culture of bacteria and yeast, SCOBY）进行为期10天的红茶菌型发酵，系统比较发酵对理化特性、酚类与挥发性成分谱、抗氧化能力、酶抑制活性、HepG2细胞生长与基因表达以及感官接受度的影响。研究背景在于，SCOBY发酵已被广泛用于改善植物基饮料的功能特性，可通过微生物生物转化修饰多酚谱、提高低分子量酚类可利用性并生成生物活性更佳的代谢物；然而相关研究多集中于茶基体系，针对鹅莓汁的应用信息有限，尤其红、白鹅莓之间植物化学组成的天然差异在发酵后是否保留、如何受蔗糖或蜂蜜等碳源选择调控，以及发酵驱动的组成变化与生物学响应之间的对应关系，均缺乏深入认识。已有研究提示，植物酚类的加工修饰可通过解聚、脱糖基及结合态释放等途径显著改变其组成与性质，而传统上以总多酚含量与抗氧化能力衡量品质的做法，未必能反映细胞水平效应。基于此，研究人员提出假设：发酵将引起基质依赖性的植物化学组成变化，且由此产生的生物活性不一定与总多酚丰度成比例；为此，研究将组成变化与抗氧化及酶抑制活性、HepG2细胞生长和代谢及致癌信号相关基因表达并行评价，以解析发酵诱导的植物化学重塑与鹅莓基发酵饮料功能特性之间的关系。研究得出，SCOBY发酵显著改变了鹅莓基饮料的化学组成与功能特性，表现为糖耗竭、乙醇与有机酸积累以及多酚与挥发性成分谱的广泛重塑；这些变化伴随抗氧化能力与部分酶抑制活性升高，但幅度取决于鹅莓基质与碳源。红鹅莓基饮料具有更高的总酚含量及总体更强的抗氧化与酶抑制活性，其中蜂蜜补充变体数值尤高；然而，尽管具备上述组成与功能特征，源自白鹅莓发酵产物的多酚提取物对HepG2细胞生长的抑制作用强于红鹅莓来源提取物，说明提取物的细胞效应不能仅由总酚含量或抗氧化能力预测，酚类馏分的定性组成及发酵诱导的转化可能是生物活性的重要决定因素。白鹅莓来源提取物的基因表达分析进一步显示，其对参与代谢稳态与致癌信号的基因具有化合物依赖性调节，表明细胞响应复杂而非一致的有利分子效应。感官评价显示，蔗糖补充的发酵红鹅莓汁总体感官轮廓最佳，而蜂蜜补充的红鹅莓变体抗氧化能力与酶抑制活性尤高，表明功能特性的最大化未必带来最高消费者接受度。研究的重要意义在于，证明SCOBY发酵是广泛修饰鹅莓基饮料化学与功能特性的有效途径，且其效应强烈依赖果实基质与碳源，化学组成、体外生物活性、细胞响应与感官接受度并不必然遵循同一模式，提示在评价与优化果实基发酵饮料时需整合组成、生物学与感官分析。需要指出的是，研究采用共同的红茶菌液态发酵剂而未设置发酵剂特异性对照，限制了将单个酚类化合物及相关生物活性完全归因于鹅莓基质或发酵诱导的转化；同时微生物计数仅在发酵起点与终点进行，无法直接评估发酵中期（第5天）的菌群变化，α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶抑制率始终较低，不足以支持体内降糖功效的结论。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：以红、白鹅莓商品汁为样本队列来源（购自波兰Jó?wiak Sady Katarzyna Jó?wiak），按2×2因子设计补充蔗糖或荞麦蜂蜜（各80 g/L），加入红茶菌液态发酵剂（100 mL/L）与SCOBY（100 g）于23 °C静置发酵10天，设3次独立发酵作为生物学重复；采用培养计数法测定总活菌数（TVC）、 presumptive乳酸菌（LAB）、醋酸菌（AAB）及酵母与霉菌；以HPLC测定有机酸与糖谱、近红外光谱测定乙醇；采用超高效液相色谱-光电二极管阵列-四极杆飞行时间质谱（UPLC-PDA-Q/ToF-MS）分析酚类化合物；采用顶空固相微萃取Arrow-气相色谱-质谱（HS-SPME Arrow-GC/MS）分析挥发性有机化合物（VOCs）；以ABTS、DPPH、FRAP法及COX-1/COX-2、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶（AChE）与丁酰胆碱酯酶（BuChE）抑制实验评价抗氧化与酶抑制活性；以Amberlite XAD-16树脂制备多酚提取物，采用台盼蓝计数法评价HepG2细胞生长与活力并计算IC25与IC50，以qRT-PCR测定目标基因表达；并采用9点嗜好量表由20名未经训练成年消费者进行感官评价。

研究结果方面，2.1 Changes in Culturable Microbial Populations During Fermentation：通过发酵起点与第10天的培养计数发现，总活菌数在所有饮料中升高，红鹅莓汁补充蔗糖（RGJ-S）由6.0 × 10³升至4.1 × 10⁴ CFU/mL，红鹅莓汁补充蜂蜜（RGJ-H）由3.2 × 10³升至4.0 × 10⁴ CFU/mL，白鹅莓变体终值较低；presumptive LAB增幅最大，红鹅莓基质终值达4.4 × 10⁵与3.5 × 10⁵ CFU/mL，明显高于白鹅莓基质，而presumptive AAB多数样品低于10² CFU/mL，仅RGJ-S与白鹅莓汁补充蔗糖（WGJ-S）可检出，提示其微生物轮廓不同于传统茶基红茶菌；酵母与霉菌计数亦大幅升高，最大增幅见于两种红鹅莓配方及白鹅莓汁补充蜂蜜（WGJ-H）。研究同时指出，培养依赖性计数仅反映可培养微生物，且仅于起点与终点取样，无法确证各菌群对代谢物的相对贡献。2.2 Chemical Changes During Fermentation：通过理化分析发现，总可溶性固形物由10.5–14.4 °Brix降至5.8–9.1 °Brix，蔗糖补充变体中蔗糖由约890 mg/100 mL大幅下降，蜂蜜补充变体初始蔗糖较低并降至2.4 mg/100 mL或低于定量限，果糖与葡萄糖亦明显耗竭；乙醇逐步积累，第10天以WGJ-S最高（6.28%），其次为WGJ-H（4.76%）与两种红鹅莓变体（4.27%）；乳酸由约0.01升至0.66–0.72 g/100 mL，苹果酸升至1.52–1.78 g/100 mL，乙酸在第10天达2.20–3.03 g/100 mL，而葡糖醛酸未检出；最终pH收敛于2.73–2.82，干物质下降，黏度变化依配方与发酵阶段而异，表明发酵引起基质广泛转化且pH本身不足以表征酸化程度。2.3 Transformation of Polyphenolic Compounds：通过UPLC-PDA-Q/ToF-MS分析发现，已鉴定多酚总量由777.24–1220.89升至980.92–1859.69 mg/L，红鹅莓汁尤其蜂蜜补充变体终值最高；酚酸类呈化合物特异性变化，咖啡酰苹果酸与咖啡酰奎宁酸下降，而奎宁酸衍生物、三没食子酰奎宁酸及部分丁香酸、阿魏酸衍生物升高；黄烷-3-醇变化最显著，(?)-表没食子儿茶素在WGJ-S升高1.80倍、在RGJ-H升高2.23倍，(?)-表没食子儿茶素没食子酸酯在WGJ-S升高3.58倍、在RGJ-H升高7.20倍，暂定为没食子儿茶素没食子酸酯（GCG；未知异构体）者在红鹅莓变体升高8.67与9.13倍，而B型原花青素二聚体与四聚体总体下降；花青素仅见于红鹅莓基饮料且相对稳定，部分化合物略降或升高；黄酮醇呈异质性响应，部分芸香糖苷与鼠李糖苷下降，而槲皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-新橙皮糖苷、花旗松素-3-O-葡萄糖苷及红鹅莓中的槲皮素-3-O-桑布双糖苷升高；茶黄素类浓度较低，茶黄素-3,3′-没食子酸酯总体升高，但鉴于以红茶菌液态发酵剂启动，此类茶相关化合物可能部分源自发酵剂而非基质中新生成，且未设发酵剂特异性对照，故各来源贡献无法完全区分。总体表明发酵导致多酚谱再分布而非各类酚类一致升高。2.4 Volatile Compounds Profile：通过HS-SPME Arrow-GC/MS分析发现，已鉴定VOCs以醇类与酯类为主，并含酸、醛、酮、萜类与萜烯类及呋喃衍生物；红鹅莓基饮料酯类贡献较高，RGJ-S总酯在前5天升高并维持至第10天，主要涉及乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯与十二酸乙酯增加，而RGJ-H酯类较稳定；白鹅莓基饮料以醇类为主要VOC馏分，WGJ-S总VOC在第5天显著下降后趋稳，涉及醇、酯、酸、醛及萜类，而WGJ-H总体变化较小、醇类始终占优；作者强调表中所列醇类不含乙醇，后者以另一方法单独测定，且D_0样品已含液态发酵剂，故不宜将挥发性醇变化与乙醇积累直接比较，稳定的浓度也可能反映生成与转化的同时进行。2.5 Antioxidant and Enzyme Inhibitory Activities：通过DPPH、ABTS与FRAP及酶抑制实验发现，抗氧化能力总体在第10天最高，红鹅莓基饮料高于对应白鹅莓变体，蜂蜜补充者一般高于蔗糖补充者，RGJ-H的DPPH、ABTS与FRAP分别由145.26、202.35、320.51升至165.37、251.36、451.22 μmol Trolox/100 mL；COX-1抑制在所有配方中升高，RGJ-H第10天达92.99%，COX-2抑制较温和，同一样品为52.12%；未稀释样品的AChE抑制由9.28–22.89%升至11.90–35.18%，BuChE抑制由11.89–29.56%升至18.00–36.19%，仍以RGJ-H最高；而α-淀粉酶抑制仅由2.05–5.54%升至3.04–6.25%，α-葡萄糖苷酶抑制由7.18–11.06%升至7.88–12.08%，幅度远低于COX-1与胆碱酯酶，作者据此指出结果仅代表有限的体外酶抑制活性，不足以支持体内降糖功效。2.6 Effects of Polyphenolic Extracts on HepG2 Cells：2.6.1 Cell Growth and Viability通过台盼蓝计数法评价树脂制备的多酚提取物发现，白鹅莓来源提取物对HepG2细胞生长的抑制作用强于红鹅莓来源，WGJ-H的IC25最低（14.3 μg/mL），WGJ-S为15.2 μg/mL，其IC50（31.5与51.4 μg/mL）亦低于红鹅莓来源提取物（蜂蜜与蔗糖补充者分别为202.3与84.2 μg/mL）；甜味剂类型未见明显规律性影响；200–400 μg/mL时多数样品几无存活细胞，提示高浓度可能存在细胞毒性，故后续实验选用25 μg/mL；该结果与红鹅莓样品抗氧化能力及总酚更高相悖，说明总酚浓度与化学抗氧化能力不足以预测细胞响应，提取物定性组成及成分间相互作用可能更为关键。2.6.2 Gene Expression通过qRT-PCR（以GAPDH为参照）检测发现，WGJ来源提取物使G6PC下调30–50%，FABP4表达升高逾10倍，ALDH1L1显著下调，WNT10B在WGJ-H处理下升高55%而WGJ-S无统计学显著变化，EPCAM在两种处理下均下调约50%，SERPINE1在对照组与处理组间无差异但WGJ-H显著低于WGJ-S；作者指出转录响应方向因基因而异，不构成对WNT通路的普遍抑制，也不支持一致的有益或抗癌分子效应，FABP4上调是否为一过性尚需时程实验验证。2.7 Sensory Analysis of Fermented Gooseberry Beverages：通过9点嗜好量表由20名未经训练消费者评价发现，未发酵红鹅莓汁多数属性得分最低，而两种发酵红鹅莓配方感官轮廓明显改善，RGJ-S在外观与总体评分最高并在滋味与酸度上获高评价，WGJ-S在滋味与甜度上表现良好；蔗糖补充发酵饮料在滋味、甜度、酸度与总体评分上高于对应蜂蜜补充配方，而气味评分格局不同，未发酵白鹅莓汁在气味上评价较佳；作者强调尽管终产品糖耗竭、pH约2.7–2.8且乙醇达4.27–6.28%，感官结果仍应视为特定小组与条件下的小规模初步观察，需更大规模多样化小组与描述性分析验证；同时功能特性最高的配方（RGJ-H）与感官接受度最高的配方（RGJ-S）并不一致，提示功能性与消费者接受度之间存在潜在权衡。

讨论部分总结指出，四种发酵配方的比较表明SCOBY发酵效应取决于鹅莓汁类型与碳源，不同配方在不同评价终点上表现更优：红鹅莓饮料一般具有更高的已鉴定酚类浓度与更强的抗氧化能力，蜂蜜补充的红鹅莓配方（RGJ-H）终酚浓度最高且抗氧化响应尤强，但这些组成优势并未转化为最强的HepG2细胞生长抑制，反而是发酵白鹅莓饮料来源的多酚提取物（尤其WGJ-H与WGJ-S）在该细胞模型中抑制作用更强；感官接受度又呈不同格局，蔗糖补充的红鹅莓配方（RGJ-S）总体评分最高，WGJ-S在滋味与甜度上亦获良好接受。研究据此强调，最有利的配方取决于目标产品特性，酚类丰度、抗氧化能力、细胞响应与感官接受度应作为彼此不同的结果而非可互换的品质指标。研究同时指出局限性：以共同的红茶菌液态发酵剂启动而未设发酵剂特异性对照，限制了对单个酚类化合物及相关生物活性的归因；微生物计数仅于起点与终点进行，无法评估第5天的菌群变化；细胞实验使用多酚提取物而非全饮料，故乙醇、有机酸及其他未提取发酵代谢物的直接贡献无法确定；感官评价样本量与小组代表性有限。

研究结论部分翻译如下：SCOBY发酵大幅改变了鹅莓基饮料的化学组成与功能特性，导致糖耗竭、乙醇与有机酸积累以及多酚与挥发性成分谱的广泛重塑。这些组成变化伴随抗氧化能力与部分酶抑制活性升高，但响应幅度取决于鹅莓基质与碳源。特别是α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶抑制始终较低，不支持关于降糖功效的结论。红鹅莓基饮料表现出更高的总酚含量以及总体更强的抗氧化与酶抑制活性，蜂蜜补充变体数值尤高。然而，尽管具备这些组成与功能特征，源自白鹅莓发酵产物的多酚提取物对HepG2细胞生长的抑制作用强于源自红鹅莓者。这一差异表明，提取物的细胞效应不能仅由总酚含量或抗氧化能力预测，并提示酚类馏分的定性组成与发酵诱导的转化可能是生物活性的重要决定因素。对白鹅莓来源提取物的基因表达分析进一步揭示了对参与代谢稳态与致癌信号基因的化合物依赖性调节，表明细胞响应复杂而非一致的有益分子效应。感官评价为发酵的配方依赖性效应提供了另一视角：总体感官轮廓最佳者为蔗糖补充的发酵红鹅莓汁，而蜂蜜补充的红鹅莓变体表现出尤高的抗氧化能力与酶抑制活性。采用共同的红茶来源发酵剂而未设发酵剂特异性对照，限制了将单个酚类化合物及相关生物活性完全归因于鹅莓基质或发酵诱导的转化。这一差异表明，功能特性的最大化未必带来最高的消费者接受度，在设计发酵果实饮料时应予以考虑。总之，本研究表明SCOBY发酵是广泛修饰鹅莓基饮料化学与功能特性的有效途径；重要的是，其效应强烈依赖果实基质与碳源，且化学组成、体外生物活性、细胞响应与感官接受度并不必然遵循同一模式。这些发现凸显了在评价与优化果实基发酵饮料时整合组成、生物学与感官分析的重要性。