DirectClean：面向Oxford Nanopore direct-cDNA转录组测序的伪影感知预处理与读段挽救框架

《NAR Genomics and Bioinformatics》：DirectClean: artifact-aware preprocessing and read rescue for Oxford Nanopore direct-cDNA transcriptome sequencing

Oxford Nanopore direct-cDNA测序能够在不进行PCR扩增的情况下实现全长转录组分析，但逆转录和文库构建过程中反复出现的嵌合伪影可能影响异构体重建和基因融合分析。这些伪影包括折返倒位、异常引物构型、内部接头串联体以及同聚物介导的模板转换事件。现有的预处理策略主要针对基于引物的方向校正和接头检测，仍有若干direct-cDNA特异性伪影类别未被解决，且常丢弃仍含可用转录序列的读段。研究人员开发了DirectClean，一个伪影感知的预处理与读段挽救框架，整合了链方向判定、伪影去除以及可恢复嵌合读段在连接位点水平的分割。在四个direct-cDNA数据集上的基准测试显示，DirectClean的读段和碱基保留率始终高于Pychopper。在VCaP中，DirectClean保留了65.2%的读段，而Pychopper为57.6%，支持了额外的转录本，并将嵌合读段率从原始数据的30.9%降至16.9%。半合成验证表明，对与接头相关的及A/T富集的嵌合读段可实现准确挽救，匹配的真实数据分析显示分割来源读段相对于匹配的未处理读段未出现新转录本模型的富集。DirectClean为direct-cDNA转录组的伪影感知预处理提供了可重复、开放可用的框架，并提高了下游异构体和融合分析的可靠性。

研究背景方面，Oxford Nanopore direct-cDNA测序无需PCR扩增即可实现全长转录本分析，保留天然转录本结构并避免扩增偏好，但原始读段在下游分析前需预处理。关键步骤之一是链方向校正，因为来自第一链或第二链互补DNA（cDNA）的读段须转换为一致的5′→3′方向。预处理还须处理逆转录（RT）和文库构建过程中引入的结构伪影，包括折返倒位、接头串联体和RT模板转换事件。同聚物介导的RT模板转换在direct-cDNA数据中尤为常见，发生于逆转录酶解离后在A/T富集区重新引发时。过滤这些伪影常丢弃无法置信分类的读段，降低可用数据量，在无PCR方案中尤为突出，因为每个读段代表一个独特转录本。现有工具中，Pychopper作为Oxford Nanopore Technologies（ONT）的标准工具，在读段末端存在有效引物对时通过检测内部接头连接进行链方向判定和嵌合体挽救，但缺乏完整或可识别末端引物的读段仍无法分类并被丢弃，即使内部序列可恢复。Restrander利用polyA/T信号改善链方向判定并标记异常引物构型，但不挽救嵌合体并移除所有被标记或无法定向的读段。NanoPrePro针对基于PCR的cDNA试剂盒优化接头检测，但未针对direct-cDNA数据设计或验证。重要的是，现有预处理流程均未整合链方向判定、序列挽救以及对折返倒位和同聚物介导RT模板转换的同时检测，且被排除的读段不会被重新审视以进行恢复。因此研究人员开发了DirectClean，一个针对ONT direct-cDNA数据的端到端预处理流程，整合链方向判定、伪影去除和序列挽救。DirectClean整合Breakinator用于折返倒位去除、Restrander用于链校正和引物伪影识别，并引入三个额外模块：未知读段挽救从初始未分类序列中恢复可定向读段；接头挽救应用锚定延伸策略检测内部接头连接，在检测到的连接处分割读段并保留满足最小长度要求的片段；同聚物挽救在A/T富集连接处识别RT模板转换并分割嵌合体同时保留侧翼子读段。通过解析而非丢弃嵌合读段，DirectClean提高了数据保留率。研究人员利用半合成真值读段和匹配的真实数据对照评估挽救性能，在四个direct-cDNA数据集中DirectClean保留的读段和碱基均多于Pychopper；在VCaP前列腺癌direct-cDNA数据中，将嵌合读段率从30.9%降至16.9%，并相对于Pychopper为额外转录本提供读段支持。该研究的重要意义在于为direct-cDNA转录组的伪影感知预处理提供了可重复、开放可用的框架，提高了下游异构体和融合分析的可靠性。

关键技术方法方面，DirectClean流程包含五个阶段：Stage 1应用Breakinator去除折返倒位；Stage 2使用Restrander将读段定向至5′→3′并丢弃异常引物构型读段，产生定向读段和不可定向读段（unknowns）；Stage 3扫描unknowns池中的内部接头并恢复可定向子读段；Stage 4扫描定向读段中的接头相关结构并修剪无支持的末端残留或分割有支持的内部串联体；Stage 3至4输出合并后用minimap2以剪接感知模式比对至参考基因组；Stage 5从比对中识别同聚物介导的RT模板转换连接并分割嵌合体。内部接头检测使用edlib半全局比对，连接检测采用锚定延伸搜索，同聚物检测采用10-bp滑动窗口应用A/T含量≥85%且最长连续A或T运行≥5 bp双标准。研究使用VCaP前列腺癌细胞系的5 348 910条ONT direct-cDNA读段，以及SG-NEx的A549、HCT116和HEYA8三个公共direct-cDNA数据集（ENA登录号PRJEB44348），VCaP数据存放于GEO（登录号GSE277934）。半合成验证从真实VCaP序列片段生成11 200条读段，包括600条接头相关构建体、300条预期被分割的A/T富集嵌合体、300条预期不被分割的不合格嵌合体和10 000条未处理背景读段。转录本模型用IsoQuant v3.11.1生成，并用SQANTI3 v5.4对照GENCODE v41分类。基因融合用FusionSeeker以--minsupp 5调用。

研究结果方面，在DirectClean流程处理中，对VCaP的5 348 910条原始ONT direct-cDNA读段应用DirectClean：Stage 1去除434 375条折返倒位读段（8.1%）；Stage 2定向剩余读段并保留3 386 185条，另有1 528 350条被分类为unknowns；Stage 3扫描unknowns中的内部接头连接并恢复53 407条定向读段；Stage 4处理231 974条含接头相关结构的定向读段并产生233 921条保留的挽救片段；合并和比对后，Stage 5检测到46 957条同聚物介导的嵌合体并产生95 332条保留片段；最终输出包含3 489 914条读段（65.2%保留率）。在分割与挽救模块的贡献与验证中，比较仅Stage 1和2与完整流程的转录组指标，完整流程产生103 729条额外读段，支持29 343个转录本，包括429个在Stage 1–2后未获支持的挽救相关转录本，6435个转录本的读段深度增加；429个挽救相关转录本的同聚物富集覆盖高于两次分析均支持的转录本（中位数2.398%对1.474%；P=4.32×10?1?），RepeatMasker重叠在挽救相关转录本中未富集。半合成真值测试中，DirectClean对98.0%含接头相关伪影的半合成读段产生预期修剪或分割结果，所有可评估断点均在设计的接头位点恢复；87.3%的A/T富集嵌合读段按设计端到端分割；对于由Stage 5处理的子集，95.3%的A/T富集嵌合体被正确分割，而297/300=99.0%的不合格嵌合体被正确保持未分割；10 000条未处理背景读段均未被分割。在VCaP和HCT116中比较分割来源读段与匹配未处理读段，NIC+NNC模型占分割来源VCaP读段重建模型的0.10%，占匹配未处理VCaP读段的0.46%；在HCT116中相应比例为0.34%和1.05%，因此分割来源读段相对于匹配未处理读段未显示NIC/NNC转录本模型富集。在与现有预处理工具比较中，四个ONT direct-cDNA数据集中DirectClean保留的读段和碱基均多于Pychopper，记录产出率DirectClean为65.2%至73.5%、Pychopper为51.4%至65.9%，碱基保留率DirectClean为65.4%至73.3%、Pychopper为42.8%至58.0%；VCaP详细比较中DirectClean保留3 489 914条读段（65.2%），Pychopper为3 082 960条（57.6%），NanoPrePro仅保留84 159条读段（1.6%）并因产出率低被排除下游比较；DirectClean在Stage 3和4挽救287 328条接头来源片段，Pychopper为103 388条，另去除434 375条折返倒位并解析46 957条同聚物介导嵌合体，这些伪影类别Pychopper未针对；将DirectClean同聚物检测器应用于Pychopper输出识别出70 140条残留同聚物相关伪影，而DirectClean输出中未检测到；转录组水平上DirectClean检测到更多FSM异构体（20 535对17 873），有读段支持的转录本从27 851增至29 343，为6826个Pychopper处理后未获支持的转录本提供读段支持，并增加16 077个转录本的读段深度；DirectClean在四个数据集中所需墙钟时间为Pychopper的1.13–3.78倍，峰值内存为19.65–24.00 GiB，Pychopper为0.59–0.74 GiB。在嵌合读段减少与读段命运分析中，嵌合读段率从原始30.9%降至Pychopper的26.8%和DirectClean的16.9%；FusionSeeker以--minsupp 5在原始数据中报告1154个融合候选，Pychopper处理后1006个，DirectClean处理后878个；追踪原始数据中全部1 333 230条嵌合读段，69.1%在处理中被去除或解析，其中32.6%由折返去除、27.5%由丢弃不可定向读段、5.9%由接头挽救、3.1%由同聚物挽救，其余30.9%作为嵌合比对保留在最终输出中。

讨论与结论部分，DirectClean为ONT direct-cDNA数据提供了端到端预处理框架，整合链方向判定、伪影去除和序列挽救；通过将成熟工具与三个挽救模块（unknowns、adapter和homopolymer挽救）结合，通过连接分割而非整读段去除来解析嵌合读段，在无PCR方案中最大化数据保留。在四个direct-cDNA数据集中DirectClean保留的读段和碱基多于Pychopper；在VCaP中还支持额外转录本并将嵌合读段率从30.9%降至16.9%。半合成验证表明对与接头相关的及A/T富集的嵌合读段可实现准确挽救。分割来源读段相对于匹配未处理读段未显示NIC/NNC转录本模型富集，表明分割后未产生过多新转录本结构。当前局限性在于同聚物挽救依赖基于比对的检测，可能遗漏缺乏补充比对的伪影，未来工作可纳入序列或信号水平方法以弥补这一空白。