Queuosine修饰依赖性组氨酰tRNA片段以细胞类型依赖方式促进细胞增殖

《Nucleic Acids Research》：Queuosine-modification dependent histidyl tRNA fragment promotes cell-type dependent proliferation

　　

tRNA片段（tRFs）是由内源性核糖核酸酶切割tRNA产生的天然小非编码RNA。tRFs在包括细胞增殖调控在内的多种生物学通路中发挥作用。特定的tRNA修饰影响tRF的生物发生。Queuosine（Q）修饰发生于4种哺乳动物tRNA的反密码子摆动位核苷酸，并保护这些tRNA免受片段化。本研究探讨了细胞类型和tRNA Q修饰依赖性对哺乳动物细胞增殖的影响。研究人员发现，Q修饰的tRNA对增殖可表现为促进、抑制或无影响。在乳腺癌细胞系MCF7中，当tRNA被Q修饰且依赖修饰酶复合体QTRT1/2时，增殖下降。转染Q修饰依赖性tRF^His可增加MCF7增殖，而敲低内源性tRF^His则降低增殖。与Q依赖性增殖抑制一致，多聚核糖体谱分析显示核糖体蛋白的翻译效率下降。最后，利用tRF^His对MCF7裂解液进行蛋白pull-down，鉴定出Musashi RNA结合蛋白2（Msi2）为tRF^His结合蛋白。敲低Msi2可减弱Q修饰依赖性或以tRF^His依赖性的细胞增殖效应。研究结果揭示了tRNA Q修饰具有高度细胞类型依赖性的增殖效应，提示在研究这一普遍存在的tRNA修饰时需考虑多方面机制。

研究背景：tRNA是细胞内修饰最为丰富的RNA分子之一，平均每条tRNA携带约13种化学修饰，这些修饰影响解码效率与准确性、稳定性、氨酰化等多种tRNA功能。Queuosine（Q）修饰是一种独特的真核tRNA修饰，其生物合成在后生动物中完全依赖肠道微生物和/或饮食。Q修饰发生于Tyr/His/Asn/Asp四种tRNA反密码子的摆动位G34，由QTRT1和QTRT2蛋白组成的酶复合体催化将queuine碱基整合到胞质和线粒体tRNA上。Q修饰可提高tRNA氨酰化效率、赋予密码子偏好性并改变翻译保真度，同时保护其同源tRNA免受内源性片段化。tRNA片段（tRFs）是tRNA经内源核糖核酸酶切割产生的产物，可装载于Argonaute蛋白引导特定基因沉默，或螯合RNA结合蛋白促进特定mRNA转录本降解，在细胞增殖调控中发挥作用。然而，Q修饰如何以细胞类型依赖方式影响细胞增殖尚不清楚。已有文献报道Q修饰对哺乳动物细胞增殖可表现为促进、抑制或无影响，但这些不一致结果来自不同实验室的独立研究，且文献中普遍存在将Q修饰增加等同于增殖增加的假设，缺乏对Q修饰如何实际减缓增殖的机制研究。因此，研究人员开展了细胞类型依赖的tRNA Q修饰对细胞增殖影响的系统性研究，旨在为Q修饰减缓增殖提供机制基础。研究发现，在测试的六种细胞系（HeLa、MEF、HCT116、MCF10A、MDA-MB-231和MCF7）中，仅ER+乳腺癌细胞系MCF7在tRNA被Q修饰时表现出增殖减慢。无Q修饰的MCF7细胞产生更高水平的Q可修饰tRNA^His片段（tRF^His），转染tRF^His可缓解增殖减慢效应，而敲低内源性tRF^His则加剧该效应。通过同时检测Q修饰依赖性tRNA丰度和修饰的tRNA-seq以及多聚核糖体谱mRNA-seq，发现tRNA性质变化和密码子使用模式与无Q修饰时增殖增加相一致。此外，研究鉴定出Musashi RNA结合蛋白2（Msi2）为tRF^His结合蛋白，敲低Msi2可减弱tRF^His依赖性增殖。该研究发表于《Nucleic Acids Research》，揭示了tRNA Q修饰具有高度细胞类型依赖性的增殖效应，提示在研究这一普遍存在的tRNA修饰时需考虑多方面机制，为理解Q修饰与细胞增殖之间复杂关系提供了新的机制视角。

关键技术方法：研究人员采用透析胎牛血清培养建立Q缺失（Q?）细胞，添加1 μM queuine建立Q恢复（Q+）细胞；使用shRNA稳定敲低QTRT1/QTRT2、siRNA敲低Msi2、反义寡核苷酸（ASO）敲低tRF^His；通过CCK-8法测定细胞增殖；采用高灵敏度Northern blot检测tRF水平；利用多重小RNA测序（MSR-seq）同时分析全长tRNA丰度、修饰及多聚核糖体关联mRNA；通过多聚核糖体谱分析（polysome profiling）评估翻译效率；使用生物素化tRF^His进行蛋白pull-down结合质谱鉴定结合蛋白。细胞系来源包括人宫颈癌细胞（HeLa）、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）、人结直肠癌细胞（HCT116）、非致瘤性乳腺上皮细胞（MCF10A）、ER?乳腺癌细胞（MDA-MB-231）和ER+乳腺癌细胞（MCF7）。

研究结果：

（1）增加的tRNA queuosine修饰降低MCF7细胞增殖，但可被tRNA片段挽救。研究人员在六种细胞系中比较Q?和Q+条件下的增殖，发现4种细胞系无差异，MCF10A在Q+时增殖增加，MCF7在Q+时增殖降低。敲低QTRT1或QTRT2可增加MCF7 Q+细胞的增殖，表明queuine依赖性效应对MCF7增殖与tRNA Q修饰相关。MCF7高表达ERα和ERβ受体，先前研究显示tRF^His在ER+乳腺癌细胞中表达。tRNA^His是Q可修饰tRNA，Q修饰影响tRF生物发生。高灵敏度Northern blot检测发现Q?细胞中两条tRF^His条带水平显著高于Q+细胞，MSR-seq鉴定出两个主要的5′ tRNA片段。转染tRF^His寡核苷酸可显著增加Q+ MCF7细胞增殖，而使用ASO敲低内源性tRF^His则显著降低Q? MCF7细胞增殖。

（2）tRNA Q修饰适度影响其他促进翻译的tRNA修饰。MSR-seq分析显示Q?和Q+细胞中tRNA丰度无显著变化（>1.5倍），4种Q修饰胞质tRNA丰度差异约20倍，但基因组密码子使用仅差异约1.9倍。研究人员比较了Q?和Q+细胞中m¹A58和m³C32两种促进翻译的修饰，发现Q?细胞中m¹A58整体增加约5%，m³C32在tRNA^Arg(CCT)、tRNA^Ser和tRNA^Thr中增加约2%，这些位点甲基化水平增加可能适度支持Q?细胞翻译效率的提高。

（3）tRF^His增加MCF7细胞翻译。对转染tRF^His或tRFSC对照的Q+ MCF7细胞进行多聚核糖体谱分析，发现tRF^His转染增加多聚核糖体密度。输入样本mRNA差异很小，但多聚核糖体关联mRNA存在显著差异。翻译效率比较鉴定出395个上调转录本和303个下调转录本。GO分析显示上调基因富集于细胞代谢过程，下调基因富集于信号转导。密码子使用分析发现上调基因显著偏好C/G结尾密码子，人类核糖体蛋白基因也显著偏好C结尾密码子，tRF^His转染细胞中核糖体蛋白基因翻译效率显著高于对照。此外，tRF^His转染后Q写入酶QTRT1翻译下降，m¹A写入酶TRMT61A翻译增加。

（4）Msi2蛋白结合tRF^His。细胞组分分离结合Northern blot证实天然tRF^His存在于MCF7细胞质中。以固定化tRF^His为诱饵拉取细胞质蛋白，tRFSC为对照，SDS-PAGE显示约55、38和32 kDa处存在显著差异蛋白条带。质谱分析30–40 kDa区域 top 10蛋白中，6个为hnRNP蛋白，3个为核糖体或核糖体成熟蛋白，Msi2位列其中。Msi2已被报道可结合tRFs并调控胰腺β细胞增殖。

（5）Q修饰对MCF7增殖的效应依赖Msi2。敲低Msi2显著降低Q?细胞增殖，但对Q+细胞增殖影响很小。联合si-Msi2和tRF转染实验显示，在si-CTRL细胞中tRF^His转染较tRFSC显著增加增殖；si-Msi2-1条件下tRF^His不再增加增殖，si-Msi2-2条件下tRF^His虽仍增加增殖但幅度较si-CTRL降低。结果表明Q修饰和tRF^His对MCF7细胞增殖的效应依赖Msi2蛋白。研究人员提出模型：Q修饰减少增加tRF^His水平，tRF^His与Msi2蛋白互作增加细胞代谢，进而增加核糖体蛋白翻译并加速细胞增殖。

讨论部分总结：先前研究已证明angiogenin核糖核酸酶负责在反密码子环切割成熟tRNA，这些tRFs的积累功能性地参与细胞增殖。在ER+乳腺癌和AR+前列腺癌细胞系中，tRF halves组成性产生并依赖性别依赖性激素的存在。由于tRNA Q修饰已知保护tRF生物发生，研究人员将tRNA Q修饰及来自Q修饰tRNA的tRFs与细胞类型依赖性增殖联系起来。与先前报道一致，Q修饰依赖性tRF^His足以增加ER+乳腺癌MCF7细胞增殖，最可能通过其与Msi2蛋白的相互作用。缺乏tRNA Q修饰的MCF7细胞还伴随其他细胞tRNA中m¹A和m³C修饰水平增加，可能也促进翻译效率，但其机制联系尚不清楚。tRF^His转染促进富含C/G结尾密码子基因转录本的翻译，包括核糖体蛋白基因。Msi1和Msi2均为已知RNA结合蛋白，调控关键致癌通路中基因转录本的翻译，并与多种癌症类型相关。先前研究显示这两种蛋白均可结合tRFs，并阐明了Msi1在tRFs线粒体定位中的作用，促进新生β细胞增殖。本研究发现Msi2是tRF^His的关键结合蛋白，介导MCF7细胞中tRNA Q修饰依赖性增殖效应。未来工作将进一步研究为何tRF^His与Msi2互作特异性影响ER+乳腺癌细胞增殖。

研究结论翻译：总之，研究人员发现tRNA Q修饰对哺乳动物细胞增殖具有强烈的细胞情境依赖性。在所检测的六种细胞系中，仅两种显示出显著的增殖差异，其中一种在较高tRNA Q修饰水平下表现出非预期的增殖减慢。这种细胞情境依赖性指向Q修饰效应的复杂性，需要在细胞类型依赖的基础上进行研究。