Integrator复合物在转录偶联修复后移除损伤滞留的RNA聚合酶II以促进转录重启

《Nucleic Acids Research》：Integrator complex removes lesion-stalled RNA polymerase II after transcription-coupled repair to facilitate transcription restart

　　

RNA聚合酶II（Pol II）介导的基因转录对转录阻断性DNA损伤（TBLs）高度敏感，若未及时解除，将诱发转录应激，进而导致细胞衰退与衰老。TBLs由转录偶联核苷酸切除修复（TC-NER）途径清除。TC-NER由科凯恩综合征B组蛋白（CSB）识别损伤滞留的Pol II并促进TC-NER复合物组装而启动。该复合物招募TFIIH进行损伤验证，随后经切割与修复以实现转录重启。多种TBLs使Pol II滞留于其活性中心内，从而遮蔽损伤使其无法被修复，因而需要对Pol II进行加工以暴露损伤。然而，这一过程究竟通过Pol II回溯还是从DNA上释放来实现，以及所涉及的调控机制，目前仍不明确。本研究发现Integrator复合物是损伤滞留Pol II加工的关键因子。相互作用蛋白质组学揭示Integrator被招募至晚期TC-NER复合物。Integrator的核酸内切酶核心促进TBL诱导后的高效转录恢复，而不影响TC-NER对损伤的清除。活细胞成像与染色质滞留实验表明，Integrator促进TC-NER后Pol II从DNA上释放。总体而言，这些发现支持TC-NER过程中Pol II清除的两步机制：TFIIH介导的回溯暴露损伤以供修复，随后Integrator介导的Pol II释放以恢复转录。

研究背景：RNA聚合酶II（Pol II）介导的转录对维持细胞完整性与正常功能至关重要，但延伸中的Pol II易受DNA损伤影响而停滞。转录阻断性DNA损伤（TBLs）可来源于内源性醛类及紫外线（UV）等环境因素。若TBLs未被正确解除，将引发转录应激，驱动与衰老相关的细胞衰退、衰老与凋亡。转录偶联核苷酸切除修复（TC-NER）是清除此类细胞毒性损伤的重要途径，可去除活性基因转录链上多种 bulky DNA损伤，如UV诱导的光产物、链内交联及DNA-蛋白质交联（DPCs）。TC-NER的重要性由科凯恩综合征等遗传疾病所凸显，该病由TC-NER基因失活突变引起，表现为进行性神经退行与早衰。TC-NER由科凯恩综合征B组蛋白（CSB）启动，CSB可区分损伤滞留的Pol II与其他形式的转录暂停Pol II。当因bulky DNA损伤导致旁路失败时，CSB稳定结合于损伤滞留的Pol II，通过招募CSA与UVSSA启动TC-NER以组装完整TC-NER复合物。CSA作为Cullin-RING泛素连接酶复合物CRL4CSA的一部分被招募，泛素化Pol II及TC-NER因子CSB与UVSSA。Pol II泛素化促进TC-NER进程，由ELOF1及新近鉴定的TC-NER因子STK19支持。UVSSA通过直接结合TFIIH的p62亚基促进TFIIH招募。STK19通过与XPD直接相互作用在TFIIH正确定位中发挥重要作用。TFIIH与XPA、RPA共同解旋DNA，损伤验证后由结构特异性核酸内切酶ERCC1-XPF与XPG经双重切割切除TBL，含TBL的DNA片段随后被排出，产生的单链DNA（ssDNA）缺口由DNA聚合酶修复并连接，从而允许转录重启。多数TBLs（包括UV诱导的环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）与6-4光产物（6-4PPs））在到达Pol II活性中心时使其停滞，形成高度稳定的复合物。因此这些TBLs被完全包埋于Pol II延伸复合物内，这种空间遮蔽阻止了由TFIIH、XPA、RPA、XPF/ERCC1与XPG组成的切割复合物对TBL的校对与切除。为允许修复，损伤滞留的Pol II必须被加工以将TBL暴露于下游切割复合物。然而，Pol II究竟如何被加工以将TBL从TC-NER复合物移交至切割复合物，以及涉及哪些因子，仍很大程度上未知。已提出若干非互斥模型：一种模型提出Pol II发生回溯（反向易位），从而暴露TBL而Pol II仍结合于DNA模板；细菌中的生化与结构研究证明解旋酶UvrD促进RNA聚合酶回溯以暴露转录阻断性损伤以供修复，由于回溯是细胞RNA聚合酶的保守特征，哺乳动物TC-NER中亦提出类似机制，TFIIH可能是促进该回溯的候选因子，近期冷冻电镜模型提示TFIIH的易位酶XPD亚基处于最佳位置，可利用其5′-3′易位酶活性将TBL从Pol II活性中心拉向TFIIH，从而推动Pol II后退。另一种可能是损伤滞留的Pol II因提前转录终止而被主动释放，但尚不清楚这发生于TC-NER期间以为切割机器提供损伤通路，还是作为修复后果发生于较晚时刻。Pol II也可能通过降解被清除，但Pol II降解很可能不是修复期间的主要机制，因为介导泛素化Pol II染色质提取与降解的泛素依赖性分离酶VCP/p97对TC-NER及TC-NER proficient细胞中损伤滞留Pol II的移除并非必需；相反，当TC-NER受损时VCP/p97促进损伤滞留Pol II的提取与降解，表明蛋白酶体Pol II清除主要作为TC-NER受限条件下的失效保护机制。本研究鉴定Integrator复合物为细胞响应转录应激过程中调控损伤滞留Pol II释放的重要因子，这与先前一项多组学研究提示Integrator复合物参与该通路相一致。Integrator复合物是Pol II转录的多功能调控因子，由15个亚基（INTS1–15）组成约1.5 MDa的复合物，结合Pol II C端结构域（CTD）。Integrator最初因U-rich小核RNA（snRNAs）的3′端加工而被鉴定，现已被认为是转录的广泛调控因子，控制蛋白编码与非编码RNA。Integrator的关键功能是RNA切割，由其核酸内切酶模块（INTS4、INTS9与INTS11）介导，其中INTS11提供催化活性。该核酸内切酶活性不仅加工snRNAs，还切割新生mRNA以在启动子近端与早期延伸位点诱导提前转录终止，或在延伸后期转录停滞或非生产性时发挥作用。此外Integrator含有丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A（PP2A）模块，由INTS5、INTS6与INTS8锚定PP2A异二聚体，去磷酸化Pol II CTD上的pSer2及DSIF等相关延伸因子。Integrator的Int-PP2A模块拮抗CDK9活性，后者通常促进暂停Pol II向生产性延伸转变。该调节在许多蛋白编码基因上发生，从而精细调控启动子近端暂停与转录延伸。通过其核酸内切酶与磷酸酶活性，Integrator广泛调控转录暂停、终止与应激反应，凸显其在维持转录稳态中的核心作用。本研究证明Integrator复合物通过促进损伤滞留Pol II的移除，在细胞响应DNA损伤诱导的转录应激中发挥关键作用。研究人员鉴定Integrator复合物为晚期TC-NER复合物的DNA损伤诱导型相互作用因子。然而Integrator复合物对TBLs的修复并非必需；相反，Integrator复合物促进修复发生后Pol II的排出，以实现高效转录恢复。总之这些发现支持Pol II清除的两步模型：首先Pol II回溯暴露损伤以供修复，随后Integrator复合物将先前损伤滞留的Pol II从染色质释放，允许通过从头转录起始恢复转录。本研究发表于《Nucleic Acids Research》。

研究人员开展的研究及结论与意义：研究人员通过比较野生型（WT）与STK19敲除（KO）细胞中损伤滞留Pol II复合物的组成，利用SILAC定量相互作用蛋白质组学鉴定Integrator复合物为STK19依赖的、UV损伤后结合延伸中Pol II的因子，并发现其被招募至晚期TC-NER复合物。通过CRISPR介导的基因编辑构建Halo-HA-INTS11敲入（KI）细胞系，结合Halo-PROTAC3介导的快速降解、siRNA/shRNA敲低及催化失活突变体（E203Q）回补实验，证明Integrator的核酸内切酶活性促进UV及Illudin S诱导损伤后的转录恢复，但不影响TC-NER介导的损伤修复（包括TC-NER复合物组装、切割与修复合成）。活细胞成像与染色质滞留实验（FRAP、DRB run-off、染色质分级）表明Integrator促进TC-NER后Pol II从DNA释放。研究结论支持TC-NER过程中Pol II清除的两步机制：TFIIH介导的Pol II回溯暴露损伤以供修复，随后Integrator介导的Pol II释放以恢复转录。该研究的重要意义在于揭示了Integrator复合物在DNA损伤诱导的转录应激中的未知功能，将Integrator定位为正常条件及转录阻断性DNA损伤后转录稳态的核心调控因子，并解释了回溯后Pol II无需TFIIS再激活即可被释放的机制。

关键技术方法：研究人员主要采用SILAC定量相互作用蛋白质组学（免疫沉淀质谱）分析Pol II及INTS11相互作用组；CRISPR/Cas9介导的Halo-HA-INTS11敲入结合Halo-PROTAC3快速降解系统；活细胞荧光漂白恢复（FRAP）分析CSB与GFP-RPB1的染色质结合动力学；基于微孔滤膜的局部UV损伤DRB run-off免疫荧光实验；以及EU掺入的新生转录与RNA合成恢复（RRS）检测。样本队列来源为HCT116结直肠癌细胞、RPE1视网膜色素上皮细胞与HeLa宫颈癌细胞及其衍生的KI/KO细胞系。

研究结果：（1）Integrator复合物与延伸中Pol II及TC-NER机器相互作用——通过SILAC相互作用蛋白质组学再分析发现，STK19 KO细胞中Integrator复合物与UV损伤后延伸中Pol II的结合减少程度与UVSSA、TFIIH亚基相当，GO分析显示Integrator为STK19 KO细胞中Pol II结合减少的首要因子；免疫沉淀实验证明UV损伤后INTS11与CSB、CSA及TFIIH亚基XPB、XPD相互作用，且该相互作用在NAEi抑制CRL4CSA或spironolactone降解XPB后丧失，表明Integrator被招募至CRL4CSA介导的Pol II泛素化与TFIIH招募下游的晚期TC-NER复合物。（2）INTS11促进TC-NER介导的转录恢复——通过PROTAC3降解INTS11并结合EU掺入检测发现，INTS11缺失严重抑制UV及Illudin S损伤后的转录恢复，程度接近CSB缺失细胞；shRNA敲低INTS9呈类似缺陷；催化失活的INTS11（E203Q）不能回补转录恢复而WT可回补，表明Integrator核酸内切酶活性促进转录恢复；flavopiridol洗脱后转录恢复在INTS11缺失细胞中不受影响，表明该作用特异于转录阻断性DNA损伤；ATF3在INTS11缺失细胞中后期下降，类似WT细胞，提示其转录恢复缺陷机制不同于TC-NER缺陷细胞。（3）TC-NER的DNA修复不依赖INTS11——CSB-mScarletI FRAP显示INTS11缺失不影响CSB在损伤滞留Pol II上的固定与再移动；Pol II泛素化及CSB、CSA、XPD向延伸Pol II的招募不受影响；碱性彗星实验显示trabectedin诱导的单链断裂在INTS11缺失细胞中不减少；XPC KO细胞中TCR-UDS在INTS11缺失后不受影响，表明TC-NER复合物组装、切割与修复合成均正常，INTS11作用于TC-NER下游促进转录恢复。（4）INTS11促进TBLs处Pol II的加工——流式细胞术与免疫荧光显示INTS11缺失不影响UV诱导的总Pol II降解，但pSer2修饰的转录 engaged Pol II在DNA损伤后更多滞留于染色质；GFP-RPB1 FRAP显示INTS11缺失使UV诱导的不可动Pol II比例较WT增加约50%，表明INTS11促进TC-NER期间染色质结合Pol II的移除。（5）INTS11促进TC-NER损伤位点Pol II的移除——DRB run-off实验显示INTS11缺失延迟损伤滞留Pol II的清除，呈中间表型；在UVSSA KO细胞及spironolactone处理细胞中INTS11缺失不再进一步损害Pol II释放，而在XPA KO细胞中INTS11缺失仍导致Pol II滞留，表明Integrator作用于TFIIH下游且Pol II释放不依赖损伤移除；甲醛诱导的DPCs损伤后转录恢复及Pol II固定不受INTS11缺失影响，支持Integrator特异性作用于TFIIH依赖性Pol II加工下游。

讨论部分总结：研究人员指出，尽管TC-NER机制理解已大幅进展，但修复后转录如何恢复仍不清楚；近期测序与建模研究提示转录重启主要通过启动子驱动的从头转录起始，而非从修复位点直接恢复，这与损伤滞留Pol II在细胞响应中被释放的发现一致。研究人员证明Integrator复合物虽被招募至TC-NER复合物，但对TC-NER介导的修复并非必需，而是作用于修复反应下游，通过促进初始损伤滞留Pol II从染色质清除来促进TBL修复后的转录恢复。关于损伤滞留Pol II加工的三种非互斥模型（泛素化-VCP/p97-蛋白酶体降解、回溯、提前终止释放），研究数据支持Integrator促进初始损伤滞留Pol II的解除，且依赖其核酸内切酶活性；研究人员提出Integrator核酸内切酶切割新生RNA以促进先前损伤滞留Pol II释放的机制，持续染色质结合的Pol II复合物会形成物理屏障阻碍启动子驱动转录重启的新生RNA聚合酶。该转录恢复缺陷独立于TC-NER修复缺陷，表明Integrator介导的Pol II释放并非暴露TBL以供修复的主要加工机制，而是在TC-NER后移除Pol II以确保转录恢复。研究人员还讨论了INTS12在UV损伤后转录恢复中的作用及Integrator各模块功能差异；TFIIH缺失细胞中Integrator对Pol II释放无影响，支持其作用于已加工（最可能为回溯）Pol II的二次响应；两步模型解释了回溯Pol II无需TFIIS再激活即可被释放的原因；Integrator缺失仅部分影响Pol II移除，提示可能存在XRN2、TTF2、PCF11、RPRD1B等其他清除机制并行。Integrator在TC-NER晚期、STK19与TFIIH招募下游被招募，该步骤可能是TFIIH仍与损伤滞留Pol II结合的最后阶段，从而定义Integrator特异性加载于损伤滞留Pol II复合物的最后机会。该作用特异于DNA损伤且特异于损伤类型：对UV与Illudin S诱导的bulky损伤重要，而对甲醛诱导的DPCs后重启不参与，这与两步模型一致——DPCs在到达Pol II活性中心前即阻断Pol II，无需回溯，TFIIS允许Pol II直接从修复位点恢复延伸，这也解释了TC-DPCR（约6 h）较TC-NER（≥16 h）更快的转录恢复。总之，研究将Integrator的已知功能扩展至DNA损伤诱导的转录应激，揭示INTS11作用于TC-NER下游释放初始损伤滞留Pol II，防止持续停滞的Pol II复合物阻碍启动子驱动转录重启，提出的两步Pol II加工模型为转录阻断性DNA损伤的复杂细胞响应增添了新的调控层次，并将Integrator定位为正常条件及转录阻断性DNA损伤后转录稳态的核心调控因子。

研究结论翻译：总之，本研究将Integrator复合物的已知作用扩展至其在正常转录中的功能之外，揭示了其在DNA损伤诱导的转录应激中的关键作用。INTS11作用于TC-NER下游，将初始损伤滞留的Pol II从染色质释放。若未被移除，此类持续停滞的Pol II复合物可能作为新启动延伸复合物的路障，从而阻碍高效的启动子驱动转录重启。Integrator的核酸内切酶活性虽对TBLs本身的修复并非必需，但对解除先前损伤滞留的Pol II至关重要。所提出的两步Pol II加工模型——由TFIIH介导的Pol II回溯继以Integrator依赖性染色质释放——为转录阻断性DNA损伤的复杂细胞响应增添了另一调控层次，并将Integrator定位为正常条件及转录阻断性DNA损伤后转录稳态的核心调控因子。