靶向细胞核内不同Tb-161与Lu-177分布的放射生物学效应

《Journal of Radiation Research》：Radiobiological effectiveness of varying Tb-161 and Lu-177 distributions in the nuclei of targeted cells

　　

本研究探讨了靶向细胞核内177Lu与161Tb非均匀分布的放射生物学损伤与微剂量学。采用Geant4-DNA工具包（版本11.3）对PC-3 M前列腺癌细胞进行建模。模拟中考虑了细胞核内177Lu与161Tb的均匀与非均匀分布（考虑10 MBq·s的衰变数）。为模拟细胞尺度放射性药物分布的异质性，采用均值为零、标准差为0.1–0.5的高斯分布函数。模拟基于放射性核素异质性水平评估细胞吸收剂量以及直接与间接DNA双链断裂（DSBs）。在均匀放射性核素分布下，161Tb所致DSBs数目与吸收剂量分别为0.035 decay^?1与40.62 uGy/decay，而177Lu分别为0.0093 decay^?1与11.18 uGy/decay。随着细胞核内放射性核素分布异质性增加，177Lu的细胞核吸收剂量及每细胞核吸收剂量所致直接与间接DSBs数目保持不变，而161Tb的细胞核吸收剂量及每细胞核吸收剂量所致直接DSBs数目下降（P值<0.05）。同时，161Tb的放射生物学效应对其在核内空间分布高度敏感。总体而言，本计算机模拟研究提示161Tb是放射药物治疗中极具前景的放射性核素，尤其当可实现高效核靶向与相对均匀的核内分布时。准确预测基于161Tb药物的治疗效果需仔细考虑其亚细胞分布。

放射药物治疗（RPTs）快速发展，在晚期疾病患者治疗中占据日益突出的地位。新型放射性核素与载体分子的发现使该方法成为有效且独特的治疗选择。多项研究显示177Lu-PSMA可有效治疗前列腺癌，显著降低患者PSA水平；由于177Lu有利的物理特性（发射能量适宜的γ射线），治疗过程可通过核医学成像监测，成像与剂量学程序表明177Lu-PSMA治疗在给予肿瘤显著剂量的同时对肾脏等健康组织损伤最小。161Tb亦被视为非常重要的放射性核素，由于其独特的物理特性（包括发射高能Auger电子与转换电子），其每次衰变向肿瘤传递的能量较177Lu多约35–40%；由于Auger电子与转换电子射程短，161Tb在靶向177Lu所遗漏的微小癌灶方面更有效。相较177Lu等既往放射性核素，161Tb在物理化学性质、生产方法与成本效益方面更适宜，有助于推动该治疗策略。经实验方法验证的蒙特卡洛方法在剂量学与放射生物学损伤评估方面对放射性标记治疗的进展非常有益。细胞水平的蒙特卡洛模拟可评估直接物理损伤与自由基所致间接化学损伤，可对不同类型的细胞、各种放射性核素及其多样的细胞内分布进行建模，从而考察特定条件下发生的DNA损伤类型。众多采用蒙特卡洛方法的研究已考察177Lu与161Tb在细胞水平的剂量学与放射生物学问题，聚焦放射性核素在细胞质、细胞核与细胞膜的分布，揭示了161Tb相较177Lu的优势。近期研究的局限在于未考虑细胞核内具有不同程度异质性的非均匀放射性核素分布。不同细胞类型具有不同的DNA结构复杂度与碱基对密度，因此具有不同电离密度与空间分布的放射性核素可在细胞核中导致不同速率的双链断裂（DSBs）及其他形式损伤。本研究旨在考察放射性标记同位素177Lu与161Tb在细胞核内的异质性分布，评估剂量学与放射生物学参数，研究该两种放射性核素在前列腺癌转移细胞系细胞核水平均匀与非均匀分布的放射生物学效应与微剂量学。

方法上，研究人员利用GEANT4-DNA工具包中的"molecularDNA"示例应用定义生物靶几何结构，该应用专为分子水平模拟DNA损伤设计；模拟采用"human cell"几何结构，其代表人类前列腺转移细胞系（PC-3 M）的简化模型。本研究基于放射性核素完全定位于细胞核内的基本假设，此为最大化161Tb等Auger发射体疗效的理想情形；尽管核几何与DNA组织基于PC-3 M细胞系，模拟意在代表一般靶向细胞核而非直接量化PC-3 M细胞的实验放射敏感性。FractalDNA为构建可拼接DNA几何结构的Python软件包，可构建简单DNA片段与螺线管DNA，该模块使DNA水平模拟可在Geant4-DNA中运行。DNA链形成染色质纤维并进而形成PC-3 M细胞核的各阶段中，蓝色球体代表组蛋白（碱基），黄色与红色球体构成DNA链的磷酸与糖组分，每一完整轮黄红球体形成10 bp；众多DNA链聚集形成染色质纤维，这些染色质纤维以螺旋紧凑结构排列于类似Hilbert曲线的空间内形成细胞核。PC-3 M细胞几何由基本Hilbert曲线定义的连续链构成，该分形被分割为边长50 nm的立方体积以放置平直与转折的染色质片段DNA，该链包含于半尺寸为9.5 μm×1.4 μm×5.1 μm、模拟细胞核的椭球中；仅完全包含于椭球内的立方体被视为链的一部分，其长度为6.1 Gbp。核尺寸取自经验证的Geant4-DNA molecularDNA示例；椭球几何经有意调整以在核内容纳正确DNA含量（6.1 Gbp），确保生物学上真实的染色质密度而非严格再现实验报道的核轴长度。PC-3 M细胞系几何构建以反映转移性前列腺细胞系的典型尺寸与结构特征，包括细胞膜、细胞质与细胞核的近似，其中DNA所在的细胞核被建模为半径对应人类细胞核平均大小的球形结构，从而可精确追踪核内发生的辐射相互作用，便于评估DNA单链断裂（SSBs）与DSBs。PC-3 M细胞典型体积约2000 μm³，含DNA的细胞核占据其显著部分；模拟中PC-3 M细胞核建模为尺寸9.5 μm×1.4 μm×5.1 μm的椭球，体积约68 μm³，其外被尺寸19.0 μm×1.4 μm×11.2 μm的椭球细胞质包围。建模的PC-3 M细胞核中碱基对（bp）总数约6.1 Gbp，基于典型PC-3 M细胞在约68 μm³核体积内含约6.1 Gbp DNA、对应密度约90 bp/nm³。核内DNA以复杂的分形样结构组织；分子水平上单位碱基对由六个分子组成：两对球形磷酸分子（H?PO?）与带两个椭球核苷酸碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤与胞嘧啶）的球形脱氧核糖分子作为骨架；这些DNA单元形成每碱基对旋转34°的双螺旋结构，随后由球形组蛋白紧密折叠为染色质纤维，染色质纤维进一步组织为花状环、染色体领地及整体椭球核形状。采用Geant4蒙特卡洛模拟工具包11.0版本对Lu-177、Tb-161发射粒子的输运进行建模，Geant4为粒子与物质相互作用模拟提供综合框架，包括光电效应、康普顿散射、瑞利散射、γ转换、电子电离、轫致辐射与多次散射。模拟所用Lu-177、Tb-161能谱取自MIRD数据，涵盖β粒子、X射线、γ射线、Auger电子、内转换电子与α粒子等广泛发射，该能谱信息以直方图形式导入Geant4框架进一步分析。Geant4-DNA模拟中，10 MBq·s的活度-时间乘积通过在核体积内模拟共10⁷次核衰变实现（1 Bq·s对应一次衰变），设置高初始粒子数以使蒙特卡洛模拟的统计不确定度低于5%；总沉积能量随后除以核质量以计算以Gray为单位的吸收剂量。研究考虑放射性核素的均匀与非均匀分布，非均匀源分布采用对数正态概率密度函数建模；对于服从均值μ、标准差σ正态分布的随机变量X[X~N(μ，σ²)]，给定点的浓度正比于exp(X)；本研究中底层正态分布均值取μ=0，标准差σ在0.1至0.5间变化，σ值越大对应分布越不均匀。为将该一维分布映射至三维核空间，对细胞核进行体素化，源粒子按从该函数采样的各体素概率权重分布。初级与次级电离粒子同生物物质物理相互作用的建模称为Geant4-DNA模拟的物理阶段，这些相互作用可通过激发与电离水分子及产生溶剂化电子在DNA结构中沉积能量而导致DNA直接损伤；本研究逐一计算每个事件的损伤，追踪初级粒子及产生的所有次级粒子。DNA几何采用DNA材料定义，但当前公开版"molecularDNA"不含截面数据，故目前不模拟DNA体积内的物理相互作用，预计未来Geant4版本将纳入DNA材料截面数据。物理相互作用模拟采用Geant4-DNA option4物理列表，其基于Geant4-DNA合作组先前研究，推荐用于考察DNA水平物理相互作用；相较早期研究使用的option2，option4相关物理模型为液态水能量损失函数提供更一致的方法。损伤判定时，程序查找给定能量沉积直接相互作用范围内的所有分子并将损伤赋予最近的分子；文献中直接链断裂损伤模型通常取DNA链糖-磷酸部分能量沉积之和并据此计算断裂几率，本研究通过GEANT4中/dnadamage/directDamageLower与/dnadamage/directDamageUpper命令模拟：低于directDamageLower的能量沉积从不导致断裂，高于directDamageUpper的能量沉积总是导致断裂，两界之间断裂可能性均匀上升；下限5 eV时断裂几率为零，上限37.5 eV时为1。DSB定义为相距10 bp内两条对侧DNA链上的两个SSB，此为微剂量学模拟的标准判据。化学阶段模拟假设DNA处于纯水中，未考虑分子清除剂影响，可能轻微高估间接DSB产额。物理阶段产生的激发态水分子（H2O*）与电离态水分子（H2O+）解离为自由基物种，该解离在照射后1皮秒内发生，基于Shin等所用解离通道；前化学阶段完成后，所得化学物种扩散并相互反应或与DNA靶反应，导致间接DNA损伤；采用G4EmDNAChemistry_option3化学列表提供模拟所需反应速率与扩散系数。Geant4-DNA目前可模拟水中辐解，也可能涉及清除剂等其他物质，但该方法仅关注DNA损伤的极早期阶段，在此期间靠近辐射径迹的核苷酸可受自由基物种影响；模拟化学持续时间较短，通常<5纳秒，此时间范围内多数反应因高浓度辐射刺团而发生于辐射诱导物种之间。模拟基于其起源性质（物理性即直接或化学性即间接）评估细胞吸收剂量与DNA双链断裂，断裂以两条对侧链上相距最大10 bp的两个SSB为特征。DSB起源分为直接与间接，此分类有助于探究DNA损伤诱导的不同机制与产额。图中误差棒代表各次运行的标准差（SD）；吸收剂量与DSB产额随σ变化趋势的统计学显著性采用Pearson相关分析评估，P值<0.05视为具有统计学显著性。

结果部分：（1）吸收剂量分布：研究人员呈现了等活度、均值1及不同σ值（代表不同非均匀程度）对数正态分布下177Lu与161Tb在PC-3 M细胞内的吸收剂量分布二维图，以及177Lu与161Tb在PC-3 M细胞内相对吸收剂量剖面图；表中给出不同σ值对数正态放射性核素分布下177Lu与161Tb在PC-3 M细胞核的吸收剂量非均匀性。底层正态分布（均值μ=0）的σ参数控制异质性，较小σ（如0.1）对应更不均匀（较少均匀）分布，较大σ（如0.5）对应核内更均匀分布；数值基于10 MBq·s活度定位于细胞核内的模拟计算，以保证模拟不确定度低于5%。（2）均匀分布下的吸收剂量与DSBs：细胞核由10 MBq·s的177Lu与161Tb辐射在放射性药物于细胞内均匀分布情形下的吸收剂量，换算为161Tb每衰变剂量4.06×10^?6 Gy/decay、177Lu为1.12×10^?6 Gy/decay；均匀分布下细胞核单位放射性核素活度（Bq·s）的DSBs数目。（3）吸收剂量随非均匀性的变化：细胞核吸收剂量随指示放射性药物在细胞核尺寸内分布非均匀程度的对数正态分布σ值变化，可推断随着放射性核素分布从细胞核表面分布变为整个细胞核均匀分布，161Tb所致细胞核吸收剂量增加（P值<0.05），而177Lu未见显著相关（P值>0.05）。（4）直接与间接DSBs随非均匀性的变化：随着放射性核素分布从细胞核表面分布变为整个细胞核均匀分布，161Tb所致细胞核直接DSBs增加（P值<0.05），而177Lu未见显著相关（P值>0.05）；161Tb与177Lu所致细胞核间接DSBs与放射性核素分布无显著相关（P值>0.05）。

讨论部分：Alcocer-ávila等于2020年表明161Tb所致细胞核自吸收剂量较177Lu约高3至4倍，本研究结果亦如此。该研究考察了放射性核素在细胞内的不同分布并考虑交叉照射效应，而本研究仅考虑细胞核内不同分布、未考虑交叉照射效应以考察DSBs等放射生物学损伤；未考虑交叉照射有两方面原因：其一，假设考虑交叉照射仍可能导致放射性核素及其辐射在细胞核内的非均匀性；其二，细胞核建模所需大量细节将显著增加计算时间并需要非常强大的计算机。值得提及的是，本研究的蒙特卡洛计算已在Peer-Firozjaei等的工作中得到验证，该验证研究考察了MCF-7细胞中Bi213诱导的DSBs数目，在用蒙特卡洛模拟确定DSBs数目后应用Belov等的细胞修复模型估计由此产生的γ-H2AX，并与既往实验研究比较，仅显示微小差异。本研究中161Tb单位活度所致DSBs数目约为177Lu的3至4倍，表明吸收剂量与DSBs数目间存在相关性；161Tb所致细胞核自吸收剂量约为177Lu的3.8倍，与Fran?a Velo等的结果一致；核尺寸与体积差异直接影响微剂量学模拟中的能量沉积模式与每衰变吸收剂量；本研究计算的177Lu DSB产额（0.0093 Gy^?1·Gbp^?1）处于既往蒙特卡洛研究报告值范围内，161Tb约3.8倍更高的DSB产额（0.035 decay^?1）与其丰富的Auger电子与转换电子谱所预期的高LET贡献一致。需注意蒙特卡洛模拟在纯水中进行、未纳入谷胱甘肽或氧等分子清除剂，可能高估间接DSB产额；但该局限预期影响间接DSBs的绝对数目而非161Tb与177Lu间的相对比较，因为161Tb的Auger电子与转换电子在高度局域化区域沉积能量（高自由基密度），清除剂的存在可能对161Tb损伤的淬灭效应强于低LET β发射、自由基空间更分散的177Lu，故未来模拟纳入清除剂预计将轻微减小两同位素间间接DSB产额的相对差异，但161Tb在直接DSB诱导上的优势不受影响。尽管更高的DSB产额强烈提示更高的相对生物效应（RBE），但直接外推至细胞活力或肿瘤控制概率（TCP）等临床结局是复杂的，生物学效应不仅取决于DSBs数目，还取决于其复杂性与细胞修复能力；因此这些发现凸显161Tb的高潜力，尚需实验性克隆形成试验进一步验证。在细胞核内不同放射性核素分布下，由于161Tb能谱较177Lu更丰富，可观察到吸收剂量分布更平滑；由剂量分布所得吸收剂量剖面可见，随着放射性核素分布从非均匀表面分布变为整个细胞核体积均匀分布，吸收剂量非均匀性对161Tb与177Lu以相似方式变化。随着PC-3 M细胞核内放射性核素分布变化，吸收剂量与单位吸收剂量DSBs数目的变化在161Tb与177Lu间表现不同。在临床框架下可考虑每衰变剂量：均匀分布下161Tb为4.06×10^?6 Gy/decay、177Lu为1.12×10^?6 Gy/decay；例如若目标为宏观肿瘤吸收剂量20 Gy，在高效核摄取假设下，达到该剂量所需161Tb核衰变数显著少于177Lu。需注意本研究报告的绝对剂量为归一化比较，主要关注核定位条件下161Tb相较177Lu的相对放射生物学优势；若放射性药物主要定位于细胞膜或细胞质，161Tb Auger电子的治疗优势将大幅削弱，因其短射程无法到达DNA。随着177Lu在PC-3 M细胞核内分布变化，吸收剂量与单位吸收剂量DSBs数目变化相对恒定；而161Tb情形下，随着其在PC-3 M细胞核内分布更均匀，吸收剂量与单位吸收剂量DSBs数目均增加。间接DSBs与放射性核素分布异质性（σ）无显著相关，可由辐射分解自由基的物理射程与扩散解释：低LET发射产生的短寿命自由基（·OH、·H）可扩散数十纳米，有效平均掉染色质微结构上放射性核素分布的局部变化，故间接损伤对微观尺度异质性相对不敏感；相反，161Tb的Auger电子与转换电子在DNA数纳米内产生高度局域化能量沉积与密集电离簇，直接击中DNA的概率强烈依赖放射性核素在核内定位的均匀程度，这解释了161Tb中观察到的放射性核素分布异质性与直接DSBs间的显著相关。结合表1与相关结果可推断该现象不依赖于吸收剂量分布而取决于放射性核素分布，这似因177Lu β粒子射程更大而161Tb Auger电子射程更短；考虑到161Tb的物理特性，该问题对于碱基对数目与密度不同于PC-3 M细胞的其他细胞系可能有所不同。应强调本研究纯为计算机模拟，故不直接预测实验细胞存活；克隆形成存活等生物学终点需专门的体外研究，超出本工作范围。

结论部分译文：本研究考察了161Tb与177Lu以不同非均匀程度分布于PC-3 M细胞核内条件下的吸收剂量以及直接与间接DSBs数目。本计算机模拟研究表明，与177Lu相比，161Tb在靶向细胞核内传递显著更高的吸收剂量并在每次衰变中诱导更多DSBs；同时，161Tb的放射生物学效应对其在核内空间分布高度敏感。总体而言，研究结果提示161Tb是放射药物治疗（RPT）中极具前景的放射性核素，尤其当可实现高效核靶向与相对均匀的核内分布时。准确预测基于161Tb药物的治疗效果需仔细考虑其亚细胞分布。