汞同位素可以量化通过稻田水减少水稻中甲基汞积累的脱甲基作用途径

《Chemical Geology》：Mercury isotopes quantify demethylation pathways mitigating methylmercury accumulation in rice via paddy water

　　•确定了稻田水中光脱甲基作用和微生物脱甲基作用产生的汞同位素特征。•在稻田表层水中，光脱甲基作用是去除甲基汞（MeHg）的主要途径（占73.6±6.3%）。•通过同位素混合模型，光脱甲基作用使稻米籽粒中的MeHg含量减少了20.6±6.9%。

1. 引言
甲基汞（MeHg）是一种强效的神经毒素，对全球生态系统健康构成威胁（Driscoll等人，2013年；Eagles-Smith等人，2018年；Hsu-Kim等人，2013年）。其在水生和陆地食物网中的净积累取决于无机汞（Hg）的甲基化和MeHg的脱甲基化之间的平衡（Barkay和Gu，2022年；Liu等人，2025年；Lu等人，2016年）。脱甲基作用将MeHg从水柱中去除或转化为毒性较低的形式，从而减少进入食物网的量，并控制生物体内的MeHg浓度。如果没有这一去除过程，环境中的MeHg水平将会显著升高，导致在可食用组织中积累更多（Sellers等人，1996年；Tang等人，2024年；Zhong等人，2024年）。在水生生态系统中，MeHg的去除通过两条主要途径进行：表层水中的光脱甲基作用以及整个水柱和沉积物中的微生物降解（Barkay和Gu，2022年；Du等人，2019年；Eckley等人，2021年；Kritee等人，2009年）。光脱甲基作用在表层水中特别有效，其中UVB（280–320纳米）对直接降解MeHg最为有效（Barkay和Gu，2022年；Yu等人，2024年）。光降解速率常数的比例为：光合有效辐射（PAR）（400–700纳米）为1:43:3100，UVA（320–400纳米）为1:43:3100（Fernández-Gómez等人，2013年）。这一过程的效率受光照可用性、水质清澈度以及存在光敏剂（如溶解有机物质DOM）的显著影响（Klapstein和O’Driscoll，2018年）。相比之下，微生物脱甲基作用通过两种不同的酶机制进行：汞还原酶（mer）途径可以还原无机Hg(II)和有机汞化合物，而非mer途径则专门切割碳-汞键（Barkay和Gu，2022年）。脱甲基作用的重要性不仅限于开阔水域生态系统，也扩展到受人类影响的环境，如稻田。大米是世界上超过一半人口的主食，在许多亚洲国家，大米消费是MeHg暴露的主要途径（Feng等人，2008年；Liu等人，2019a；Meng等人，2011年；Sarkar等人，2012年；Zarcinas等人，2004年）。稻田大约占全球淡水资源的四分之一（Zhong等人，2024年）。稻田表层水是一个关键界面，在这里MeHg在被稻株根系吸收之前会发生转化。Qin等人（2020年）证明土壤-水系统是稻田中MeHg的原始来源。Zhong等人（2024年）发现光脱甲基作用可使稻田水中的MeHg浓度降低82%，稻米籽粒中的MeHg浓度降低11%，从而确立光脱甲基作用是稻田生态系统中的主要MeHg去除过程。如果没有这一过程，中国稻田每年可能向下游水体释放178–856公斤的MeHg。然而，他们的基于浓度的方法无法区分稻田表层水中光脱甲基作用和微生物脱甲基作用，因为这个环境较浅，富含有机物质DOM，且微生物活跃（Barkay和Gu，2022年）。此外，光脱甲基作用可能受到微生物存在的影响（Eckley等人，2021年；Liang等人，2026年）。这阻碍了对机制的理解以及针对不同途径的缓解策略的发展：如果光脱甲基作用占主导，则需要增强光照穿透；如果微生物脱甲基作用重要，则需要管理有机物质或氧化还原条件。解决这些贡献对于预测建模和风险缓解至关重要。

汞的稳定同位素可以作为一种潜在的技术来解决上述问题，因为不同的生物地球化学途径在同位素上产生不同的分馏特征（Blum等人，2014年）。这种方法已成功应用于追踪叶片中Hg(0)的吸收和再释放（Yuan等人，2019年），量化水-气界面的Hg(0)沉积和排放通量（Zhang等人，2023年），揭示大米中甲基汞的吸收和传输（Qin等人，2020年），以及解析还原途径对稻田土壤中Hg释放的相对贡献（Zhang等人，2024年）。然而， reported的分馏因子，包括质量依赖性分馏（MDF，表示为ε202Hg）和质量无关性分馏（MIF，表示为E199Hg），由于实验条件不同而存在很大差异（Bergquist和Blum，2007年；Chandan等人，2015年；Kritee等人，2009年，2018年；Rose等人，2015年）。将这些报告的值直接应用于自然稻田系统会引入很大的不确定性，因此需要在环境相关条件下确定特定系统的同位素参数。目前还不知道稻田中光脱甲基作用和微生物脱甲基作用的具体同位素分馏因子。没有这些因子，就无法量化它们的相对贡献，从而限制了我们对MeHg循环的理解。此外，DOM组成、光透射率、pH值和微生物群落的变化可能导致稻田生态系统中的同位素特征与湖泊、河流或海洋中的不同。因此，建立特定于稻田的分馏因子是准确进行源分配、预测建模和风险缓解的前提。基于这些基础，本研究在环境相关条件下通过控制实验确定了稻田表层水中光脱甲基作用和微生物脱甲基作用的汞同位素分馏因子。然后使用这些端元值在同位素混合模型中量化这两种途径在野外环境中的相对贡献，并评估光脱甲基作用在减少稻米籽粒中MeHg富集方面的保护效果。

2. 材料与方法
2.1. 研究区域和采样点
表层水样本来自中国贵州省万山汞矿区的Gouxi地区（东经109°11′27″，北纬27°33′48″）。选择该地点有两个主要原因：首先，该地区历史上的人工汞冶炼导致当地大气中汞含量升高，新沉积的汞具有更高的生物可利用性和环境反应性（Liu等人，2021年）；其次，在该地点进行研究可以直接与同一稻田系统中关于汞循环的现有研究进行比较。具体来说，我们用于源分配建模的表层水、孔隙水和稻米籽粒的MeHg同位素数据来自同一实验地块采集的样本，确保了研究之间的一致性（Qin等人，2020年；Yin等人，2025年）。在采样过程中，使用无菌注射器从水柱中层采集表层水，以尽量减少对沉积物和固体颗粒的干扰。表层水的pH值为8.1至8.5（Yin等人，2023年），与同一生长季节在同一田地获得的值一致。表层水的总汞（THg）和MeHg的平均浓度分别为9.15±0.1 ng L?1和1.40±0.1 ng L?1（平均值±标准差，n=3）。表层水的溶解有机碳（DOC）为15.62±0.9 mg L?1（平均值±标准差，n=7）。

2.2. 微生物脱甲基作用、光脱甲基作用及联合光-微生物脱甲基作用实验的设计
为了表征MeHg的微生物脱甲基和光脱甲基作用过程中的汞同位素分馏，并确定生成的Hg(II)的同位素组成，本研究进行了两组实验。
**微生物脱甲基作用**：选择Chitinophaga dinghuensis细菌进行微生物脱甲基实验，因为它具有降解MeHg的能力，并且在稻田生态系统中普遍存在（Liu等人，2023年；Liu等人，2019b）。该菌株在中国主要水稻种植区的稻田土壤微生物组中的平均丰度为2.4±1.5%。Liu等人（2025年）证明该菌株通过氧化途径降解MeHg，主要产物为Hg(II)，且不产生可检测到的气态Hg(0)。详细的实验方案和质量控制程序见文本S1。Chitinophaga dinghuensis的纯培养物按照先前描述的生长条件制备（Lv等人，2015年）。实验方案与我们之前的研究（Zhang等人，2024年）一致。简而言之，将菌株以2%（体积比）接种到200毫升培养基中，在28°C下黑暗条件下培养（图S1）。在指数生长阶段（接种后24小时）采集细胞，以1500×g的相对离心力离心10分钟，然后重新悬浮在磷酸盐缓冲液（PBS）中。经过三次洗涤后，将细胞沉淀平均分配到几个100毫升的培养管中（反应器），每个反应器含有30毫升PBS，并在脱甲基测序前平衡2小时。微生物脱甲基实验在PBS缓冲液中进行，而不是在稻田表层水中进行，以便在无复杂环境成分（如DOM、矿物颗粒等）干扰的情况下研究该纯菌株的内在同位素分馏特征。为了确保有足够的Hg用于同位素分析，在每个反应器中加入MeHg标准品（Brooks Rand，美国），使初始MeHg浓度达到2 μg L?1，这与Chitinophaga dinghuensis的耐汞性一致（Liu等人，2025年，更多细节见文本S1）。所有反应器在28°C下以200 rpm的速度振荡（THZ-98C轨道振荡器，Yiheng，中国）。通过预定时间间隔的破坏性采样监测反应动力学，以量化MeHg。所有反应器被视为封闭系统，MeHg脱甲基过程持续120小时。在每个采样时间点，取出整个反应器内容物（30毫升）。分别在0、24、48、72、96和120小时采集三个反应器的样本，进行Hg浓度和同位素分析。在每个预定时间点，向反应器中加入1毫升SnCl2溶液（20%，体积比），将Hg(II)还原为Hg(0)，然后用高纯度N2（100毫升/分钟，3小时）吹洗，并用5毫升逆王水（40%体积比，HNO3/HCl=3:1）捕获。剩余溶液用BrCl（25%体积比，最终浓度2.5%体积比）处理24小时，将残留的MeHg氧化为Hg(II)。过量的BrCl用100 μL NH2OH·HCl（25%体积比）淬灭，随后用SnCl2将Hg(II)还原为Hg(0)并捕获。捕获的Hg存储在4°C的琥珀色瓶中，待后续进行Thg和同位素分析。

**光脱甲基作用和联合光-微生物脱甲基作用实验**：为了研究环境相关条件下的汞同位素分馏，使用野外采集的表层水作为涉及光照的MeHg脱甲基反应介质。采样过程中，使用无菌注射器小心收集表层水，以避免悬浮沉积物中的颗粒物。总共收集了5升样品，并在24小时内运输到实验室，然后存储在0–4°C直到使用。设计了两种实验设置来区分光脱甲基作用和联合光-微生物脱甲基作用途径。第一组中，水通过0.22 μm膜过滤器（Millipore，美国）过滤以去除微生物（Gu等人，2011年；Hu等人，2013年；Richard等人，2006年）。将30毫升过滤后的水分配到15个石英厌氧管中。第二组包含15个管子，每个管子含有30毫升未过滤的水。在所有管子中加入MeHg标准品（Brooks Rand，美国），使初始浓度达到1.5 μg L?1，远高于背景Hg水平（9.1±0.1 ng L?1和1.4±0.1 ng L?1），确保背景Hg的影响可以忽略。选择初始MeHg浓度是为了保证足够的产物Hg(II)用于MC-ICP-MS分析。为了促进添加的MeHg和DOM之间的平衡，所有管子用铝箔包裹并在黑暗中培养24小时（Chandan等人，2015年）。考虑到稻田水深通常<20厘米，入射的紫外线B（UVB）辐射的衰减效应有限，因此UVB驱动的脱甲基作用是自然水中MeHg降解的主要驱动力（Rose等人，2015年；Yu等人，2024年；Zhang等人，2022年）。因此，在本研究中，使用紧凑型荧光灯（PL-S 9 W/01，PHILIPS，波兰）对管子进行UVB辐射处理来启动脱甲基作用。每组采集三个管子的样本，每5小时进行一次Hg浓度和同位素分析，使用先前研究中的采样方法（Zhang等人，2024年；Zhang等人，2021年，图S2）。微生物实验持续120小时，因为微生物脱甲基速率相对较慢，需要更长时间的培养以达到足够的转化量进行同位素分析。相比之下，光脱甲基和联合实验持续20小时，因为光脱甲基速率较快，20小时足以产生足够的产物Hg(II)。在每个时间点，通过加入0.1毫升SnCl2（20%体积比）将Hg(II)还原为Hg(0)，然后用无Hg的N2（100毫升/分钟，3小时）吹洗，并用5毫升逆王水捕获。剩余的Hg用BrCl氧化为Hg(II)，然后用SnCl2还原，并用NH2OH·HCl（25%体积比）淬灭过量的BrCl，随后捕获。所有被捕获的汞样品都储存在4°C的黑暗环境中，直到进行总汞（THg）浓度和同位素分析。2.3. 总汞浓度和汞同位素分析总汞浓度采用Brooks Rand冷蒸气原子荧光光谱仪（CVAFS）根据USEPA方法1631（修订版E，USEPA，2002年）进行测定。对于同位素分析，样品被稀释至0.5–1 ng/mL的汞浓度，并通过Nu Plasma II多采集器电感耦合等离子体质谱法（MC-ICP-MS）进行分析（Yin等人，2010年）。仪器质量偏差使用铊内标（NIST-997）进行校正。每个两个样品前后都使用NIST-3133汞标准样品进行质控。产品Hg(II)和残留MeHg都进行了汞同位素组成分析。这两个数据集随后被用于线性回归分析，以确定富集因子（ε202Hg和E199Hg），以及质量平衡验证。汞同位素组成按照既定惯例报告（Bergquist和Blum，2007年）：(1)δxxHg(‰)=[(xxHg/198Hg)xsamsampmplx/(xxHg/198Hg)NISSIT3133–1]×1000其中，xxx代表199Hg到204Hg之间的汞同位素质量。202Hg/198Hg比率（即δ202Hg）用于报告MDF（Bergquist和Blum，2007年）。汞同位素的MIF以ΔxxxHg（‰）表示法报告，这是同位素比率与理论预测比率的偏差，通过方程（2）计算得出。(2)ΔxxHg(‰)=δxxHg–(κxxxx×δ202Hg)其中，系数κxx分别是199Hg、200Hg和201Hg的0.2520、0.5024和0.7520。在分析汞同位素组成时，NIST-SRM-8610的重复测量结果显示δ202Hg = ?0.54 ± 0.06‰，Δ199Hg = 0.00 ± 0.10‰，Δ200Hg = ?0.01 ± 0.08‰，Δ201Hg = ?0.03 ± 0.08‰（2SD，n = 13），与先前的研究结果一致（Bergquist和Blum，2007年；Estrade等人，2010年）。2.4. 使用同位素混合模型进行来源分配在未过滤的表层水中进行实验时，产生的Hg(II)反映了光脱甲基化和微生物脱甲基化的共同作用。基于Δ199Hg的二元同位素混合模型被用来量化每条途径的相对贡献（Qin等人，2020年；Zhang等人，2024年）：(3)Δ199Hgs = Δ199Hgp×Fp + Δ199Hgm×Fm(4)Fp + Fm = 1其中Δ199Hgs代表未过滤水中产生的Hg(II)的同位素组成，Δ199Hgp和Δ199Hgm分别代表来自光脱甲基化和微生物脱甲基化的Hg(II)。Fp和Fm表示光脱甲基化和微生物脱甲基化的贡献比例。2.5. 估计光脱甲基化对稻谷中MeHg的减少基于本研究中建立的汞同位素约束，使用稳态质量平衡模型评估表层水中光脱甲基化对稻谷中MeHg积累的减少作用。在这个模型中，来自表层水的MeHg对稻谷的贡献受到微生物脱甲基化通量与植物吸收通量比率（k）的调节。基于文献中的独立证据（Liu等人，2021年；Liu等人，2023年；Zhou等人，2020年），采用k = 0.75的中心估计值，这些证据表明这两种通量的大小相当。从这个模型中计算出由光脱甲基化导致的稻谷中MeHg的减少比例，并通过蒙特卡罗模拟得出不确定性。对k在0.3至1.5范围内的敏感性分析进行了测试，以检验估计值的稳健性。k值的完整推导、敏感性分析和理由见文本S2。2.6. 质量保证和质量控制所有脱甲基化实验都在封闭系统中进行；因此，预计每次反应中的汞质量和同位素组成都会保持一致。通过质量平衡和同位素平衡来验证数据质量和封闭系统的完整性；详细计算见文本S3。如图S3和S4所示，微生物脱甲基化、光脱甲基化和光-微生物联合实验中的质量平衡回收率分别为96.4 ± 6.6%（2SD）、92.9 ± 9.9%（2SD）和93.9 ± 9.2%（2SD）。同位素质量平衡也得到满意的结果：重建的初始MeHg值（δ202Hg = ?0.61 ± 0.16‰，Δ199Hg = ?0.01 ± 0.05‰；2SD，n = 19）与测量标准值（δ202Hg = ?0.64 ± 0.20‰，Δ199Hg = ?0.04 ± 0.05‰；2SD，n = 5；图S3）吻合良好。除非另有说明，否则富集因子的不确定性以2SD报告。蒙特卡罗结果以平均值±1SD报告，并在必要时提供95%置信区间。所有计算参数的不确定性都是使用蒙特卡罗模拟（n = 100,000次迭代）根据既定方法推导得出的（Yuan等人，2020年；Zhang等人，2024年）。模拟在MATLAB中实现，相应的源代码见文本S4。数据使用OriginPro 2018可视化，并使用SPSS Statistics 24进行统计分析。双侧p值<0.05被认为具有统计学意义。3. 结果和讨论3.1. 表层水中MeHg的微生物-光脱甲基化和光-微生物联合脱甲基化过程中的汞同位素分馏特征微生物脱甲基化MeHg。如表S1和图S4所示，MeHg的残余比例随时间逐渐减少，同时Hg(II)相应增加，证实了Chitinophaga dinghuensis的活跃脱甲基化作用。该菌株的MeHg降解效率最高约为65%，与先前的研究结果一致（Liu等人，2025年）。在整个实验过程中，质量和同位素平衡都得到维持（图S3和S5），证明了实验方法的可靠性。一阶速率常数（k）是通过将表S1至S3中显示的MeHg剩余比例（f）与时间的数据拟合到指数衰减模型来计算的。对于微生物脱甲基化，kmicrobial = 0.034 ± 0.006 h?1（R2 = 0.94）。对于光脱甲基化，kphoto = 0.012 ± 0.003 h?1（R2 = 0.95）。对于联合过程，kcombined = 0.015 ± 0.004 h?1（R2 = 0.93）。在20小时的采样窗口内，MeHg的转化率分别为微生物脱甲基化约50%，光脱甲基化约21%，联合过程约26%。这些转化率表明反应没有完全进行，支持在每次采样时应用混合模型。kmicrobial的较高值反映了不同的实验系统：微生物速率是在高细胞密度的纯培养物中测量的，没有光衰减；而光脱甲基化速率是在高DOC含量的稻水中测量的，DOC会衰减UVB。产品Hg(II)的δ202Hg值始终低于残余MeHg（表S1，图1），表明较轻的汞同位素优先降解。这导致产品Hg(II)的δ202Hg出现负偏移（最高可达?0.74‰），而残余MeHg则相对初始MeHg标准出现正偏移（最高可达+0.91‰）。相比之下，没有观察到显著的MIF；产品Hg(II)（Δ199Hg = ?0.01 ± 0.10‰）和残余MeHg（Δ199Hg = ?0.01 ± 0.06‰）的Δ199Hg值与初始MeHg的Δ199Hg值没有显著差异（p > 0.05）。这些结果与先前的报告一致，即微生物脱甲基化不会引起显著的MIF（Kritee等人，2009年；Kritee等人，2013年）。下载：下载高分辨率图像（255KB）下载：下载全尺寸图像图1. 反应物MeHg和产品Hg(II)的汞稳定同位素分馏，包括δ202Hg（MDF）和Δ199Hg（MIF）。实线和虚线分别代表基于反应物MeHg和产品Hg(II)的线性回归拟合。初始MeHg同位素组成在f = 1（0小时）时仅作为参考点，不包含在回归拟合中。回归数据的误差条表示回归的1σ标准误差。“SSR”表示残差平方和，是衡量每个回归拟合优度的指标。在这个封闭系统批量实验中，反应物MeHg和产品Hg(II)的δ202Hg值相互线性绘制（图1）。这种线性反映了近似平衡的同位素分馏，而不是热力学平衡。两个数据集都通过线性回归进行拟合；反应物MeHg的拟合得到的SSR较小（0.29对比0.32），因此我们采用了其结果，并报告ε202Hg = ?1.04 ± 0.20‰（2SD）作为该过程的表观富集因子。这个值比E. coli JM109/pPB117报告的?0.40 ± 0.20‰（Kritee等人，2009年，图2）更负，表明我们的系统中分馏作用更强。这种差异可能反映了菌株特定的代谢活性。当CHg键的酶促断裂受到速率限制时，分馏达到?0.40‰；而在传输受限条件下，分馏作用被抑制（Kritee等人，2009年）。Chitinophaga dinghuensis更负的ε202Hg表明反应不是由传输限制的；相反，高代谢活性促进了酶促断裂过程中的动力学同位素效应的充分表达（Liu等人，2025年）。这些发现强调了菌株特定生理在环境汞循环中汞同位素分馏中的重要性。应当注意，微生物端成员代表特定途径的内在同位素特征，而不是整个原位微生物群落的指标。下载：下载高分辨率图像（269KB）下载：下载全尺寸图像图2. 微生物和光脱甲基化过程中汞同位素分馏的富集因子（(a) ε202Hg和(b) E199Hg）。文献中关于淡水研究的光脱甲基化数据（Bergquist和Blum，2007年；Chandan等人，2015年；Rose等人，2015年）以箱形图显示，单个值以开放符号表示。E. coli JM109/pPB117的微生物脱甲基化（Kritee等人，2009年）用开放符号表示。本研究中Chitinophaga dinghuensis的微生物脱甲基化、稻水中的光脱甲基化以及光-微生物联合脱甲基化的数据用实心符号表示，并带有2SD误差条。（关于图例中颜色的解释，请参阅本文的网页版本。）在过滤的（0.22 μm）表层水中，光脱甲基化是唯一的降解途径，残余MeHg百分比（MeHg%）随时间逐渐下降，在光照20小时后降至最低79.0 ± 0.3%（表S2，图S5a）。这对应于约21%的最大降解效率，与报告的光脱甲基化效率一致（Bergquist和Blum，2007年；Chandan等人，2015年）。该过程中的Δ199Hg/Δ201Hg比率为1.36 ± 0.05，与MeHg光脱甲基化的特征MIF指纹一致（Bergquist和Blum，2007年，图S6）。如图3所示，汞同位素分馏显示出明显的MDF（ε202Hgphoto = ?2.36 ± 0.26‰，2SD，图3a）和显著的MIF（E199Hgphoto = ?4.23 ± 0.36‰，2SD，图3b）。这些值位于报道的光脱甲基化分馏因子范围内（Bergquist和Blum，2007年；Chandan等人，2015年；Rose等人，2015年，图2）。值得注意的是，它们比淡水系统报告的范围更负（ε202Hg范围为?2.27‰至?0.94‰；E199Hg范围为?3.41‰至?2.33‰）（Bergquist和Blum，2007年；Chandan等人，2015年；Rose等人，2015年）。造成这种差异的原因尚不完全清楚。早期淡水研究中的DOM浓度范围很广（1–20 mg L?1），这与稻水中的DOC浓度（15.6 ± 0.9 mg L?1）有重叠。因此，仅DOC浓度不太可能解释观察到的差异，而DOM组成和其他环境因素也可能起重要作用。DOM可以通过光敏途径增强MeHg的光脱甲基化（Li等人，2024年；Zhang等人，2025年）。然而，这种解释在没有直接DOM表征的情况下仍然是推测性的，因为DOM组成而不仅仅是浓度会影响光脱甲基化分馏（Chandan等人，2015年；Rose等人，2015年）。这种差异强调了环境基质对同位素分馏动态的影响，并强调了在基于现场的调查中考虑介质特定效应的必要性。为了开发准确的生态系统尺度汞循环模型，建立密切模仿真实现场环境的实验条件是至关重要的，从而获得反映原位生物地球化学过程的代表性分馏参数。需要进一步进行具有详细DOM表征的研究来验证这一机制。下载：下载高分辨率图像（517KB）下载：下载全尺寸图像图3. δ202Hg（a）和Δ199Hg（b）作为微生物脱甲基化、光脱甲基化和光-微生物联合脱甲基化实验中剩余MeHg比例的函数绘制。联合光-微生物脱甲基化MeHg。在未过滤的表层水中，支持光脱甲基化和微生物脱甲基化两种途径，20小时后MeHg%降至78.8 ± 5.0%（表S3，图S5b）。这个值与过滤系统的总体降解程度（约21%）相当，表明当两种途径同时发生时，它们会竞争相同的MeHg池，它们的 combined效率是非加性的。汞同位素数据进一步支持了这一解释。双途径系统中的MDF和MIF特征介于纯光脱甲基化和纯微生物脱甲基化过程的端成员值之间。具体来说，观察到的MDF（ε202Hgcombined = ?2.09 ± 0.19‰，2SD，图3a）显著低于过滤系统的值（ε202Hgphoto = ?2.36 ± 0.26‰，2SD），但高于微生物脱甲基化途径的值（ε202Hgmicrobial = ?1.04 ± 0.20‰，2SD）。同样，MIF特征（E199Hgcombined = ?3.11 ± 0.38‰，2SD，图3b）也显著低于其过滤对应物的值（E199Hgphoto = ?4.23 ± 0.36‰，2SD，p < 0.01）。分馏幅度的减小归因于未过滤介质中微生物和颗粒物的存在，这减少了光穿透（Eckley等人，2021年），其次可能是由于微生物活动引起的MeHg/DOM比例的变化（Chandan等人，2015年）。关键的是，显著的MIF信号（Δ199Hg/Δ201Hg = 1.32 ± 0.06，图...）。S6) 提供了直接的同位素证据，证明在自然稻田水中两种途径同时发生，其中光脱甲基化仍然是主要的去除机制。这些结果表明，汞同位素可以追踪不同的过程并量化它们的贡献，即使在复杂的多过程自然环境中也是如此。在这些过程中，基本反应机制是普遍的，包括光脱甲基化的MIF斜率和微生物脱甲基化过程中没有MIF。然而，报告的分馏系数随实验条件而有很大差异（Zheng等人，2019年）。这种变异性强调了分馏程度的生态系统特定性，因此需要在环境相关条件下进行测定。

3.2. 不同脱甲基化途径对上层水中甲基汞降解的贡献
稻田上层水的深度较浅，允许紫外线辐射大量穿透，从而形成了一个由微生物脱甲基化和光脱甲基化途径相互作用支配的环境（Barkay和Gu，2022年；Bergquist和Blum，2007年）。基于微生物脱甲基化和光脱甲基化途径特有的汞同位素分馏特征，采用了汞同位素混合模型来量化对甲基汞降解的相对贡献。端元同位素值是使用方程（S14）和（S15）（文本S5）确定的，这些方程结合了反应物甲基汞的同位素组成和每个过程的富集因子。使用上层水中甲基汞的同位素值（δ202Hg = ?0.69 ± 0.32‰, Δ199Hg = 0.35 ± 0.19‰；Yin等人，2025年）作为反应物参考，由于微生物脱甲基化没有MIF（E199Hgmicrobial = 0），因此微生物端元的Δ199Hg为0.35 ± 0.19‰。相应的δ202Hg为?1.73 ± 0.42‰，是使用图1中的ε202Hgmicrobial = ?1.04 ± 0.20‰得出的。对于光脱甲基化端元，将图3中的富集因子（ε202Hgphoto = ?2.36 ± 0.26‰, E199Hgphoto = ?4.23 ± 0.36‰）应用于反应物参考值得出δ202Hg = ?3.05 ± 0.48‰和Δ199Hg = ?3.88 ± 0.47‰。组合途径端元的计算类似，使用图3中的ε202Hgcombined = ?2.09 ± 0.19‰和E199Hgcombined = ?3.11 ± 0.38‰，得出δ202Hg = ?2.78 ± 0.43‰和Δ199Hg = ?2.75 ± 0.49‰。二元混合模型解决了这两种途径对产物Hg(II)池的分数贡献。该解决方案仅依赖于端元Δ199Hg值和测量的混合物值，而不依赖于参考反应物Δ199Hg值。参考反应物仅用于得出端元值（文本S5）。
如图4所示，未过滤上层水中产生的Hg(II)的同位素特征介于纯微生物脱甲基化和光脱甲基化途径代表的端元值之间，表明这两种过程都对甲基汞的降解有贡献。应用二元混合模型（见第2.4节）来量化每种途径的相对贡献。根据方程（3），（4），光脱甲基化占总甲基汞降解的73.6 ± 6.3%，而微生物活动贡献了26.4 ± 6.3%。这一发现与地表水中的估计结果相当，在地表水中光脱甲基化约占甲基汞损失的83%（Sellers等人，1996年）。稻田中较低的贡献可能反映了系统特定的因素，包括叶子的遮蔽（Yin等人，2025年）和水中的光衰减（Chandan等人，2015年；Eckley等人，2021年）。光脱甲基化的主导作用不仅限于淡水系统。在开阔的海洋中，飞鱼的汞同位素特征表明，56%到80%的甲基汞在进入食物网之前被光降解（Motta等人，2020年）。这一范围与湖泊和稻田中观察到的值重叠，表明光脱甲基化是各种水生生态系统中主要的甲基汞去除途径，从浅水湿地到开阔海洋都是如此。这种一致性支持在全球汞生物地球化学模型中使用统一的光脱甲基化参数化方法。此外，26.4 ± 6.3%的微生物贡献突显了生物活动的协同作用，特别是在光照受限的遮蔽或浑浊条件下。这些同时发生的甲基汞脱甲基化途径的分解为模拟稻田系统中的汞循环提供了准确的参数。

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图4. 稻田上层水中脱甲基化过程产生的Hg(II)的汞同位素组成（Δ199Hg vs. δ202Hg）。误差条代表2SD分析不确定性。箭头表示从上层水到端元（微生物脱甲基化和光脱甲基化）的富集过程。
还构建了一个使用δ202Hg的等效二元混合模型来验证基于Δ199Hg的结果。应用相同的混合方程，其中δ202Hgcombined = ?2.78 ± 0.43‰, δ202Hgphoto = ?3.05 ± 0.48‰, 和 δ202Hgmicrobial = ?1.73 ± 0.42‰，解出了光脱甲基化的分数贡献（Fphoto）（文本S6）。蒙特卡洛模拟（n = 100,000）得出Fphoto = 79.5% ± 8.2%（平均值 ± 标准差）。这个值与基于Δ199Hg的模型得出的73.6 ± 6.3%在不确定性范围内重叠，证实无论使用哪种示踪剂，光脱甲基化都是上层水中甲基汞去除的主要途径。
在这项研究中，使用了0.22μm的过滤器来抑制仅光照处理中的微生物活动，这可能会在某种程度上改变DOM组成。然而，使用未过滤水的组合实验保留了自然的DOM矩阵，得到的产物Δ199Hg值与混合模型预测一致，表明任何由过滤引起的DOM变化并没有根本影响我们的结论。
这些估计中有两个不确定性值得讨论。实验设计中没有包括一个黑暗对照组（不含UVB的未过滤水）。此外，最近的研究表明（Liang等人，2023年；Xie等人，2024年），暗活性氧（ROS）途径也可能对稻田水中的甲基汞去除有贡献。仅光照处理中应用的0.22μm过滤器可能抑制了这些ROS途径，可能导致估计的微生物贡献更高。为了评估这些不确定性的综合影响，进行了一项敏感性分析，假设现场微生物Δ199Hg端元偏离测量值+0.50‰（达到0.85‰）。这种偏移量大于通常报道的微生物过程的MIF变异性（通常在±0.15‰内，Perrot等人，2015年），但远小于光脱甲基化的MIF（?3.88 ± 0.47‰）。在这种保守假设下，重新计算的光脱甲基化贡献范围为63%到82%，与基线估计的73.6 ± 6.3%相比。这一范围与观察结果一致，即组合处理中的产物Δ199Hg（?2.75 ± 0.49‰）更接近光脱甲基化端元（?3.88 ± 0.47‰），而不是微生物端元（0.35 ± 0.19‰）。因此，即使暗ROS途径存在并且实验设计降低了它们的表达，光脱甲基化仍然是主要途径。ROS介导的脱甲基化的汞同位素分馏因子尚未确定，这是未来研究的关键方向。

3.3. 汞在稻米中的来源的同位素限制以及光脱甲基化的保护作用
汞的稳定同位素可以作为稻米中甲基汞来源的保守示踪剂，因为在植物吸收和转运过程中Δ199Hg的MIF可以忽略不计（Qin等人，2020年）。测量的稻米Δ199Hg特征值（0.17 ± 0.05‰，Qin等人，2020年）介于孔隙水（0.12 ± 0.04‰）和上层水（0.35 ± 0.19‰）（Yin等人，2025年）之间，支持其混合来源。应用二元同位素混合模型得出了定量来源分配。结果显示，孔隙水贡献了78.3 ± 11%的上层水贡献了21.7 ± 11%的稻米中的甲基汞（图5）。这种同位素方法为两种甲基汞来源的相对重要性提供了定量限制，并改进了基于定性的或通量的估计。

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图5. 稻田上层水中甲基汞脱甲基化过程的概念图。孔隙水中的甲基汞（Δ199Hg = 0.12 ± 0.04‰，Yin等人，2025年）向上扩散到上层水中。在上层水中，甲基汞（Δ199Hg = 0.35 ± 0.19‰，Yin等人，2025年）通过光脱甲基化（73.6 ± 6.3%；ε202Hg = ?2.36 ± 0.26‰, E199Hg = ?4.23 ± 0.36‰）和微生物脱甲基化（26.4 ± 6.3%；ε202Hg = ?1.04 ± 0.20‰, E199Hg ≈ 0）被去除，剩余的部分被稻根吸收（21.7 ± 11%）。光脱甲基化减少了稻米颗粒中20.6 ± 6.9%的甲基汞富集。
光脱甲基化从上层水中去除了73.6 ± 6.3%的甲基汞，这部分甲基汞占稻米颗粒中积累的21.7 ± 11%。根据稳态质量平衡模型（文本S2）的估计，光脱甲基化减少了稻米颗粒中总体上20.6 ± 6.9%的甲基汞富集。敏感性分析表明，当关键参数k（微生物脱甲基化通量与植物吸收通量的比率；见第2.5节）在0.3到1.5的合理范围内变化时，估计的减少范围从大约12%到27%，证实了20.6%的估计是稳健的，并且不强烈依赖于假设的k值。这种基于同位素的测量表明，光脱甲基化作为一个重要的自然屏障，在甲基汞被稻 plants 吸收之前拦截了其中的一部分。重要的是，这一过程是连续的。孔隙水中的甲基汞将在浓度梯度的影响下持续向上扩散到上层水中，这种持续的去除机制可能对减少稻米中的甲基汞积累有更大的影响（Windham-Myers等人，2014年；Zhong等人，2024年）。因此，上层水不仅仅是一个被动的位置，用于甲基汞从孔隙水向外扩散，而是一个主动的生物地球化学屏障，拦截并降解向上扩散到稻米的甲基汞的一部分。
本研究使用汞同位素混合模型量化了稻田系统中的甲基汞脱甲基化。估计的光脱甲基化贡献与湖泊（Sellers等人，1996年）和开阔海洋（Motta等人，2020年）报告的值相符。这种跨生态系统的不一致性支持将光脱甲基化作为预测不同环境中甲基汞生物积累的关键过程。然而，还有几个不确定性需要考虑。主要的不确定性来源于上层水混合模型中的Δ199Hg端元可能的偏差。实验室测量的速率常数可能与现场的不同。然而，同位素混合模型依赖于端元同位素组成（Δ199Hg），而不是速率常数。端元值反映了每种反应机制的固有同位素特征；只要机制保持不变，这些特征不应该随反应速率变化。尽管速率差异对通量计算很重要，例如稻米颗粒中20.6 ± 6.9%的减少，我们因此将其描述为一阶近似。核心发现是，光脱甲基化在稻田水中主导甲基汞的去除（73.6 ± 6.3%），这一发现得到了同位素混合模型的支持，并不依赖于速率常数。
在稻田水中，溶解的有机物质（富含巯基）和矿物表面很丰富，同位素交换可能会改变脱甲基化产物的同位素组成。实验室研究表明，Hg(II)和巯基结合的Hg(II)之间的同位素交换可以在与环境过程相关的时间内发生（Wang等人，2020年），并且这种交换可能会影响自然系统中汞同位素特征的解释（Zheng等人，2019年）。这些过程给我们的端元分配带来了不确定性。未来使用富集的稳定汞同位素示踪剂的研究可以帮助量化交换的程度并完善混合模型的预测。此外，光脱甲基化产生的Hg(II)可能不会永久从系统中去除。如果这种Hg(II)保持生物可利用性，它可能会被本土的甲基化酶重新甲基化（Liu等人，2019b；Zhou等人，2020年）。因此，我们在稻米颗粒中观察到的净甲基汞去除实际上考虑了这种重新甲基化，因为它基于稻米中的最终甲基汞水平。然而，光降解和重新甲基化之间的平衡可能随环境条件（如氧化还原电位、有机物质含量和微生物群落结构）而变化。
尽管如此，结果强烈支持光驱动的脱甲基化的方向和程度。通过汞同位素分析，本研究提供了这种原位降解过程效率与稻米中汞水平之间的直接联系，这是稻田食物链中的一个关键节点。这种方法补充了最近在稻田生态系统中应用汞同位素示踪剂的研究（Yin等人，2025年；Yin等人，2023年；Zhang等人，2024年），共同推进了对陆地系统中汞生物地球化学循环的理解。这种联系对于更准确地评估与食用稻米相关的人类健康风险至关重要。

4. 结论
本研究通过结合汞同位素指纹技术和同位素混合模型，提供了光脱甲基化与微生物脱甲基化相对重要性的定量限制。在模拟的稻田水条件下，我们建立了光脱甲基化（ε202Hg = ?2.36 ± 0.26‰, E199Hg = ?4.23 ± 0.36‰）和微生物脱甲基化（ε202Hg = ?1.04 ± 0.20‰, E199Hg ≈ 0‰）的明确汞同位素特征。在稻田水中获得的光脱甲基化ε202Hg比淡水范围更负。这种差异的原因尚未完全了解；DOM组成和其他环境因素可能起着重要作用，尽管在没有直接DOM特征描述的情况下这种解释仍然是推测性的。微生物的ε202Hg也比纯培养介导的脱甲基化报告的值更负。这些端元值为未来在农业和水生系统中的混合模型应用提供了关键的参考。
同位素混合建模显示，光脱甲基化占甲基汞去除的73.6 ± 6.3%，减少了稻米颗粒中20.6 ± 6.9%的甲基汞积累。这项研究的成果与湖泊表层水及开阔海域的数据相当，证实了光脱甲基作用是多种水生系统中汞（MeHg）去除的主要途径。然而，同位素分馏的程度具有生态系统的特异性，这表明必须在与环境相关的条件下确定这些分馏因子。这些发现挑战了将稻田仅视为汞来源的观点，而是揭示了稻田具有显著的天然解毒能力。结合水稻植株中由活性氧（ROS）介导的脱甲基作用（Tang等人，2024年）以及土壤中矿物质促进的微生物降解作用（Liu等人，2025年），稻田呈现出多种相互作用的保护机制，能够有效抵御汞的积累。

我们认识到这些估算结果仅基于一个观测点，因此应被视为初步推测。未来需要在不同的气候和污染条件下进行多站点采样，以验证其普遍适用性。通过实地试验测试水管理工作（例如优化水深和水质透明度），可以为提高光脱甲基效率及降低水稻中汞风险提供策略支持。

**作者贡献声明：**
- 张坤：撰写初稿、方法学设计、数据整理。
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