《Nucleic Acids Research》：Region-specific generation and retention of acetylated cohesin shape the genome-wide pattern of sister chromatid cohesion
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姐妹染色单体黏连依赖于ESCO2介导的黏连蛋白（cohesin）亚基SMC3乙酰化，然而该修饰如何在基因组范围内建立与维持仍知之甚少。本研究通过定量染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析同步进入S期的人源细胞的染色质结合动态，检测了ESCO2的染色质结合动
姐妹染色单体黏连依赖于ESCO2介导的黏连蛋白（cohesin）亚基SMC3乙酰化，然而该修饰如何在基因组范围内建立与维持仍知之甚少。本研究通过定量染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析同步进入S期的人源细胞的染色质结合动态，检测了ESCO2的染色质结合动态及其酶活性。ESCO2沿染色体广泛结合而不形成离散峰，优先定位于转录失活区域，但并不局限于富含H3K9me3或H3K27me3的异染色质。与该结合模式一致，ESCO2依赖的SMC3乙酰化在这些区域同样呈现广泛分布。相反，ESCO2的旁系同源物ESCO1主要介导黏连蛋白峰位点的SMC3乙酰化。值得注意的是，S期产生的广泛分布的ESCO2依赖型SMC3乙酰化大部分在复制后从染色质上逐渐丢失，而持续至G2晚期的那部分则在富含抑制性H3K27me3修饰的结构域中积累。本研究揭示了乙酰化黏连蛋白在复制后的选择性保留是塑造姐妹染色单体黏连全基因组结构的一个此前未被认识的重要步骤。
研究背景：在增殖的真核细胞中，DNA复制产生的姐妹染色单体在进入有丝分裂后期之前始终保持物理连接，这种姐妹染色单体黏连对于忠实的染色体分离和基因组稳定性不可或缺。黏连蛋白（cohesin）作为一种环状蛋白复合物，通过拓扑方式套捕两条染色单体来介导这一过程。赋予姐妹染色单体黏连功能的黏连蛋白复合物具有一个决定性分子特征：SMC3亚基在保守赖氨酸（对应人SMC3的K105和K106）上的乙酰化。该修饰由进化上保守的乙酰转移酶催化——酵母中为Eco1，人细胞中为ESCO1/ESCO2，其以DNA复制偶联方式建立被认为是将动态结合的黏连蛋白转化为稳定染色质结合、介导黏连形式的关键。SMC3乙酰化可拮抗黏连蛋白与装载因子NIPBL及释放因子WAPL的相互作用，在人细胞中还进一步促进黏连稳定因子Sororin的结合。因此，SMC3乙酰化受损的细胞无法建立稳定黏连，并出现染色体分离缺陷和灾难性有丝分裂。人源两个SMC3乙酰转移酶ESCO1和ESCO2在细胞内行为差异显著：ESCO1在整个细胞周期中表达，而ESCO2仅限于S期，DNA复制完成后即被降解。此前研究人员已证明ESCO1通过与PDS5A或PDS5B相互作用定位于整个间期的基因组黏连蛋白结合位点（如CTCF锚定位点），使ESCO1即使在S期之外也能乙酰化黏连蛋白。相反，ESCO2活性不依赖PDS5，且与DNA复制紧密偶联。非洲爪蟾研究显示复制前复合物在DNA复制启动时将XEco2募集至染色质，人细胞研究揭示ESCO2通过与MCM复制解旋酶及复制因子PCNA的相互作用被装载至复制位点。这些观察提示ESCO2随复制叉移动以乙酰化其附近的黏连蛋白复合物。除调控差异外，ESCO1和ESCO2在姐妹染色单体黏连中作用于不同的染色体区域。同时缺失ESCO1和ESCO2的细胞姐妹染色单体黏连完全丧失；而单独缺陷ESCO1或ESCO2的人培养细胞表现出不同的有丝分裂染色体形态改变：ESCO1缺失导致染色体臂分离，ESCO2缺失导致着丝粒附近区域黏连缺陷。ESCO2突变患者细胞（Roberts综合征）、ESCO2敲除小鼠及鸡DT40 ESCO2敲除细胞的研究支持ESCO2对着丝粒异染色质黏连有重要贡献。这些发现表明ESCO1和ESCO2不仅在调控上不同，其作用的染色体区域也不同。然而在标准ChIP-seq分析中，ESCO2仅显示少量清晰可重复的结合峰，其定位是否与异染色质相关仍未解决。近期染色体构象捕获和成像方法的进展挑战了黏连沿复制染色体均匀分布的传统观点。姐妹染色单体敏感型Hi-C（scsHi-C）能够在全基因组范围高分辨率映射姐妹染色单体接触，揭示反式姐妹接触优先富集于拓扑关联结构域（TAD）边界附近，如CTCF锚定位点。互补的超分辨成像进一步证明姐妹染色单体以黏连蛋白依赖方式在离散基因组位置频繁配对。scsHi-C揭示的一个显著例外是富含H3K27me3的TAD内存在强TAD内姐妹接触，表明兼性异染色质形成与真染色质结构域显著不同的黏连结构。总之，这些发现提示黏连以高度非均匀、染色质状态依赖的方式建立。这种黏连基因组分布如何产生，以及ESCO1和ESCO2如何差异性地贡献于这些不同黏连模式，仍未解决。本研究通过定量ChIP-seq分析同步进入S期的人培养细胞，研究了ESCO2的染色质结合动态及其酶功能（即SMC3乙酰化）。
研究人员开展的研究与结论：研究人员发现ESCO2沿染色体广泛结合而不形成离散峰，优先定位于转录失活区域，但不局限于富含H3K27me3的染色质。ESCO2依赖的SMC3乙酰化在这些区域呈现 similarly 广泛分布。值得注意的是，S期产生的大部分ESCO2依赖型SMC3乙酰化逐渐从染色体丢失，而持续至G2晚期的SMC3ac富集于高水平H3K27me3标记的基因组区域。研究人员观察到的SMC3ac区域特异性保留可解释姐妹染色单体黏连的全基因组模式如何建立。总之，这些发现完善了当前对人细胞中黏连结构如何受空间和时间调控的理解。重要意义：本研究揭示了ESCO2介导黏连生成中两个此前未被认识到的层面——全基因组非峰位黏连蛋白的广泛复制偶联乙酰化，以及SMC3ac在富含H3K27me3结构域内的区域特异性保留，为理解人源疾病中的黏连缺陷提供了机制框架。论文发表在《Nucleic Acids Research》。
关键技术方法：研究采用双胸苷阻断法同步化人HeLa S3细胞，结合流式细胞术验证细胞周期同步性；使用RNA干扰敲低ESCO1、ESCO2和MCM7；采用校准（spike-in）ChIP-seq技术，以小鼠C2C12染色质或H2B-GFP小鼠骨髓脾细胞作为内参进行定量比较；通过定量Western blotting（Jess自动化毛细管Western系统）检测SMC3ac/SMC3比值；利用ChIP-qPCR在代表性位点验证；采用HDAC8抑制剂PCI-34051和EZH2抑制剂EPZ-6438进行化学抑制实验；生物信息学分析使用DROMPA软件包进行峰 calling 和归一化折叠富集（nFE）计算，并利用公共ChIP-seq和RNA-seq数据集（Roadmap Epigenomics、ENCODE）进行整合分析。样本队列来源为人HeLa S3细胞和小鼠C2C12细胞。
研究结果：（1）ESCO2在全基因组呈现广泛染色质结合——通过校准ChIP-seq在同步化人细胞中检测ESCO2结合模式，发现ESCO2富集区域跨越数百kb，不形成离散峰，且该信号在G2期消失，ESCO2敲低后信号降至背景水平，证明其为真实的非定位性染色体结合。（2）ESCO2与MCM解旋酶在未复制DNA上共定位——MCM7 ChIP-seq同样显示非定位性广泛结合，ESCO2与MCM7信号在全基因组高度相关（早期S期r=0.75，中期S期r=0.88），且二者均特异性结合未复制DNA，nFE与复制比例呈强负相关。（3）ESCO2/MCM7结合在转录活跃区域耗竭——ESCO2/MCM7结合与H3K36me3、H3K79me2及RNA聚合酶II结合呈强负相关，而与H3K9me3和H3K27me3呈正相关；分层分析表明nFE仅在高H3K36me3区域降低，在其余各组不论H3K9me3或H3K27me3状态均保持高水平；元基因分析证实ESCO2/MCM7结合在基因体尤其是高转录基因中降低。（4）ESCO1主要介导黏连蛋白峰位点的SMC3乙酰化——校准ChIP-seq显示对照组SMC3ac峰与黏连蛋白结合位点共定位并依赖黏连蛋白完整性；ESCO2敲低对峰高影响极小，而ESCO1敲低显著降低峰高，双敲低降低更甚，表明峰位点SMC3乙酰化主要由ESCO1介导，ESCO2在ESCO1缺失时提供部分补偿。（5）ESCO1和ESCO2在非定位性黏连蛋白乙酰化中的差异作用——双敲低几乎完全消除复制相关的SMC3ac nFE增加，单敲低则减弱增加；低H3K36me3区域（约占基因组70%）在ESCO2存在时S期SMC3ac增加更大，即使在G2期这些区域仍以ESCO2依赖方式保留较高SMC3ac水平；ESCO1对G2期非定位性SMC3ac的贡献在早期复制区域（ERR）大于中晚期复制区域，尤其在富含H3K36me3的ERR中ESCO1成为主要贡献者；而在低H3K36me3的MRR和LRR（约占基因组55%）中ESCO2是主要酶；黏连蛋白峰密度在ERR中高于MRR或LRR，提示ESCO1依赖性非定位性SMC3ac可能源于峰位点乙酰化后乙酰化黏连蛋白沿DNA扩散。（6）S期生成后非定位性SMC3ac的HDAC8依赖性下降——通过比较晚期G2与早期S、中期S和G2，发现SMC3ac水平在复制完成后停止增加并随后下降；HDAC8抑制剂PCI-34051处理使中期S和G2期乙酰化水平显著高于未处理细胞，独立支持染色质结合SMC3ac的减少至少部分依赖HDAC8。（7）SMC3ac优先保留在富含H3K27me3的染色质中——在G2细胞中SMC3ac与H3K36me3和RNA聚合酶II结合呈负相关，而与H3K27me3呈强正相关；在晚期G2该正相关更强，而与其他转录相关标记的关联基本消失；分层分析显示SMC3ac nFE与H3K27me3的正相关在ERR和MRR中比LRR更显著；晚期G2中SMC3ac nFE在富含H3K27me3区域高于其他两组；EZH2抑制剂EPZ-6438几乎完全消除全基因组H3K27me3信号，同时降低非定位性SMC3ac信号，且在未处理细胞中H3K27me3水平最高的区域降低最显著，SMC3ac nFE与H3K27me3的相关系数从0.44降至0.30，支持H3K27me3或与其相关的染色质环境 contribute 于晚期G2非定位性SMC3ac的优先保留。
讨论与结论总结：本研究揭示了ESCO2介导黏连生成中两个此前未被认识的层面：全基因组非峰位黏连蛋白的广泛复制偶联乙酰化，以及SMC3ac在富含H3K27me3结构域内的区域特异性保留。这些发现完善了黏连蛋白乙酰化如何生成和稳定的当前模型，并为姐妹染色单体黏连的全基因组结构提供了新见解。定量ChIP-seq分析揭示ESCO2在S期优先结合未复制、转录失活区域，其广泛分布模式解释了此前绘制ESCO2基因组占据图失败的原因。ESCO2依赖的SMC3乙酰化同样呈现弥散分布，解决了生化研究已确立S期黏连蛋白乙酰化增加但经典黏连蛋白峰位点SMC3ac水平不变的矛盾。ESCO2与MCM解旋酶相互作用且ChIP-seq谱几乎相同，ESCO2在中期和晚期复制区域复制启动前即可检测到，提示其与复制前复合物结合。研究的重要发现是S期产生的SMC3ac并非稳定维持而是随时间逐渐减少，持续至晚期G2的部分显著富集于高水平H3K27me3区域。由于黏连性黏连蛋白的存在可能干扰启动子-增强子通讯和转录延伸，其在转录抑制结构域中的选择性稳定可能代表一种进化策略，以限制黏连性黏连蛋白在活跃基因中的破坏潜力。H3K27me3富集区域SMC3ac水平高于H3K27me3和H3K36me3均低的区域，且EZH2抑制降低非定位性SMC3ac，提示H3K27me3或相关染色质环境 contribute 于优先保留，但SMC3ac降低幅度远小于H3K27me3近完全丢失，因此优先保留不太可能仅依赖乙酰化黏连蛋白对H3K27me3的直接识别。Roberts综合征由ESCO2功能障碍引起，以发育缺陷、生长迟缓和染色体分离异常为特征，患者细胞显示着丝粒附近黏连丢失；哺乳动着丝粒周围区域据报道含H3K27me3标记染色质，提示此类染色质中SMC3ac的优先维持可能 contribute 于稳健的着丝粒周围黏连。本研究强调染色质环境在塑造ESCO2依赖型黏连蛋白乙酰化功能结局中的重要性，并为理解人类疾病中的黏连缺陷提供机制框架。研究结论翻译：本研究确定了乙酰化黏连蛋白在复制后的选择性保留是塑造姐妹染色单体黏连全基因组结构的一个此前未被认识的重要步骤。
