室管膜运动纤毛快速丢失驱动缺血性脑卒中后经室管膜脑脊液内流与脑水肿

《Cell Press Blue》：Rapid ependymal cilia loss drives transependymal CSF influx and brain edema after ischemic stroke

　　

脑水肿（Brain edema）是缺血性脑卒中等神经系统疾病的危及生命的并发症，由于其病理生理机制尚未明确，目前缺乏有效治疗手段。类淋巴系统（glymphatic system）——一种血管旁脑脊液（CSF）流动——已被认为参与水肿形成，但其他脑脊液动力学的作用仍不清楚。本研究报道，经室管膜内流（transependymal influx）——一种跨室管膜细胞从脑室系统进入周围实质的细胞旁脑脊液流动——在雄性小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）后显著增加并驱动脑水肿。进一步研究表明，这种经室管膜内流的激增由缺血诱导的经NMDAR（NMDA受体）钙信号传导后室管膜运动纤毛的快速丢失所触发。最后，研究发现通过抑制HDAC6（组蛋白去乙酰化酶6）药理学促进纤毛再生可抑制经室管膜内流并减轻水肿。综上，本研究揭示了室管膜运动纤毛是脑室-实质脑脊液运输的守门员，并提出了促进纤毛再生治疗神经系统疾病的治疗途径。

缺血性脑卒中是全球第二大死亡原因，其并发症脑水肿是导致患者预后不良的重要因素。目前对缺血性脑水肿的治疗选择有限，主要原因是其潜在机制尚未完全阐明。传统上，缺血性脑水肿根据疾病进展分为细胞毒性水肿、离子性水肿和血管源性水肿三个阶段。离子性水肿发生在细胞毒性水肿与血管源性水肿之间，以血脑屏障（BBB）破坏前的细胞外水肿为特征。既往认为离子性水肿的水来源是血浆经跨毛细血管Na⁺内流，但近期研究表明缺血性脑卒中后离子性水肿阶段Na⁺内流并未增加。近年来，类淋巴系统被认为参与缺血性脑卒中后离子性水肿的形成，因此脑脊液是否贡献于离子性脑水肿的水来源成为研究热点。然而，类淋巴系统之外的脑脊液动力学的作用 largely 未知。本研究旨在探究缺血性脑卒中超急性期血脑屏障破坏前脑脊液动力学的整体图景及其对离子性脑水肿的贡献。在探究类淋巴系统参与水肿病理生理学的过程中，研究人员意外发现经室管膜脑脊液内流——一种从脑室系统跨室管膜层进入周围实质的次要细胞旁脑脊液流动——在超急性期大幅增强并触发缺血性脑水肿。

研究人员首先建立MCAO小鼠模型，通过脑含水量评估证实缺血性脑卒中后超急性期即形成急性脑水肿。通过向枕大池注射脑脊液示踪剂OVA-488（MW: 45 kDa）评估类淋巴系统功能，发现MCAO后类淋巴流入和硬脑膜流出均受到抑制。鉴于类淋巴系统受抑而脑水肿仍然发生，研究人员聚焦于经室管膜脑脊液内流，通过向侧脑室注射示踪剂发现MCAO后经室管膜内流在双侧半球均增加，以同侧为主，且在MCAO后初始30分钟及30分钟至1小时期间均持续增加。通过H&E染色观察到MCAO后60分钟同侧侧脑室受压，提示急性脑室周围肿胀；MRI显示MCAO后60分钟同侧DWI高信号和ADC低信号（细胞毒性水肿），同时侧脑室周围T2高信号和轻度FLAIR高信号（脑室周围间质性水肿），证实超急性期确实发生脑室周围间质性水肿。

为探究经室管膜内流增强的机制，研究人员首先评估MCAO后脑脊液产生，发现MCAO后15分钟内脑脊液产生受抑，颅内压（ICP）降低，脑室系统流出未受阻。进一步聚焦室管膜细胞，发现MCAO后30分钟室管膜层黏附连接、缝隙连接未破坏，室管膜层无明显的组织解构，室管膜屏障完整性保持，且无室管膜细胞凋亡或AQP4水通道转位。基于室管膜运动纤毛在产生脑室壁附近定向脑脊液流动中的生理功能，研究人员提出经室管膜内流增强可能是由于缺血后室管膜纤毛功能障碍所致的假说。通过乙酰化微管蛋白免疫组化评估，发现MCAO后30分钟同侧室管膜纤毛快速丢失，且室管膜纤毛面积与经室管膜内流呈负相关。对侧亦观察到中度纤毛丢失。

由于HDAC6促进初级纤毛解聚，研究人员向侧脑室注射HDAC6选择性抑制剂tubacin，发现可阻止MCAO后30分钟室管膜纤毛丢失，并减轻MCAO后1小时脑水肿及抑制经室管膜内流。进一步研究发现，钙螯合剂BAPTA-AM同样可阻止纤毛丢失，而钙离子载体ionomycin注射可导致纤毛严重丢失，表明细胞内钙信号调控室管膜纤毛丢失。通过重新分析小鼠脑单核RNA测序（snRNA-seq）数据，发现小鼠室管膜细胞中等表达NMDAR2A（Grin2a），免疫组化证实其蛋白表达。向侧脑室注射NMDAR2A选择性拮抗剂TCN 201可阻止MCAO后纤毛丢失。重新分析人脑snRNA-seq数据发现人室管膜细胞在NMDAR2（Grin2）亚基中高表达NMDAR2A（Grin2a），免疫组化证实人室管膜细胞中NMDAR2A强表达，并在缺血性脑卒中死后人脑组织中观察到室管膜纤毛丢失。为排除药物非特异性效应，研究人员使用AAV4载体特异性感染室管膜层，通过shRNA敲低室管膜Hdac6或Grin2a，发现均可阻止MCAO后30分钟纤毛丢失并抑制经室管膜内流。

在治疗方面，研究人员在MCAO后30分钟（纤毛已丢失时）向侧脑室注射HDAC6抑制剂，发现次日纤毛再生并伴随运动功能恢复，经室管膜内流受抑，脑水肿减轻。进一步在MCAO后30分钟和1天多次注射HDAC6抑制剂，发现MCAO后2天纤毛再生、脑水肿减轻、经室管膜内流受抑，MCAO后1周运动功能恢复且梗死体积减小。值得注意的是，纤毛再生后类淋巴流入和硬脑膜脑脊液运输几乎不受影响，表明室管膜纤毛可能不驱动类淋巴系统流动。

讨论部分指出，本研究揭示了经室管膜脑脊液内流是缺血性脑卒中后脑水肿形成的重要 contributing 因素，补充了类淋巴系统之外的脑脊液动力学图景。经室管膜内流是一种可调控的脑脊液流动，室管膜运动纤毛作为脑室-实质脑脊液运输的守门员，可能在多种中枢神经系统疾病的生理和病理条件下发挥作用。研究还发现室管膜NMDAR2A在病理条件下的关键作用，且人室管膜细胞高表达NMDAR2A及缺血性脑卒中后人脑室管膜纤毛丢失，提示这些发现可能具有临床转化意义。此外，通过HDAC6抑制促进室管膜纤毛再生可减轻缺血性脑卒中后脑水肿，提示促进纤毛再生是脑水肿的新型治疗策略。研究还表明室管膜纤毛可能不驱动类淋巴系统，为整合类淋巴系统与经室管膜及脑室内脑脊液流动的脑脊液动力学提供了全面图景。研究局限性包括：使用美托咪定-咪达唑仑-布托啡诺麻醉方案而非以往研究常用的氯胺酮-赛拉嗪；未探究NMDA受体以外的室管膜钙通道的贡献；不能排除HDAC6抑制剂通过保护BBB完整性减轻水肿的可能性；仅分析了两例人类缺血性脑卒中样本。研究结论为：经室管膜脑脊液内流在缺血性脑卒中后显著增强并驱动脑水肿，其机制为缺血诱导的经NMDAR2A钙信号触发室管膜运动纤毛快速丢失，药理学促进纤毛再生可抑制经室管膜内流并减轻水肿，室管膜运动纤毛是脑室-实质脑脊液运输的守门员，促进纤毛再生是神经系统疾病的一种治疗途径。