《European Journal of Cell Biology》：Dual Pathways of Extracellular ATP Action in Cancer Cells: Macropinocytic ATP Internalization and Purinergic Signaling–Driven Senescence
编辑推荐：
细胞外ATP（eATP）是肿瘤微环境中的重要信号分子，在肿瘤微环境中的浓度可达0.1–1 mM，由浸润的免疫细胞和缺氧相关肿瘤细胞分泌。在这些升高的浓度水平下，eATP作为应激和危险信号激活嘌呤能受体（PR），特别是P2X7，从而调控多种癌症表型。既往研究（包
细胞外ATP（eATP）是肿瘤微环境中的重要信号分子，在肿瘤微环境中的浓度可达0.1–1 mM，由浸润的免疫细胞和缺氧相关肿瘤细胞分泌。在这些升高的浓度水平下，eATP作为应激和危险信号激活嘌呤能受体（PR），特别是P2X7，从而调控多种癌症表型。既往研究（包括研究人员自身的工作）已表明，肿瘤水平的eATP可诱导非小细胞肺癌（NSCLC）中的上皮–间充质转化（EMT）、癌症干细胞（CSC）形成及耐药性。这些效应类似于TGF-β信号所诱导的效果，且PR激活与促进EMT和CSC程序的下游通路相关联。除受体介导的信号传导外，癌细胞通过巨胞饮（macropinocytosis）主动清除细胞外营养物质，该内吞过程将细胞外液和大分子内化进入称为巨胞饮体（macropinosome）的大囊泡中。巨胞饮在多种致癌环境中增强，包括RAS驱动的肿瘤，并对代谢适应有实质性贡献。研究人员此前已证明，eATP在肺癌和乳腺癌细胞中通过巨胞饮在体外和体内被内化。这种摄取增加了细胞内ATP（iATP）水平并激活促进EMT、干性和耐药性的代谢和信号通路。巨胞饮的药理学抑制或STC1等调节因子的遗传调控可减少ATP内化并逆转上述多种促癌表型。细胞衰老是一种应激响应状态，特征为形态增大、稳定的细胞周期停滞和衰老相关分泌表型（SASP）。尽管历史上被认为是一种抗癌机制，衰老现在被认为具有情境依赖性且常常促进癌症。衰老肿瘤细胞可通过SASP重塑微环境、增强邻近细胞的恶性特征、促进治疗耐药，并在某些癌症中重新进入细胞周期并获得增强的干性特性。衰老通常通过衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性检测，该活性由溶酶体生物合成增加和半乳糖苷酶β1（GLB1）表达驱动，与患者生存不良相关。因此，衰老细胞日益被视为治疗靶点，衰老细胞溶解剂（senolytic agents）——一类设计或鉴定用于选择性消除衰老细胞的药物——已成为新的抗癌策略。基于eATP在PR信号传导和巨胞饮摄取中的既定作用，研究人员假设eATP在癌细胞中发挥双重但不同的效应：巨胞饮介导的eATP内化和PR介导的衰老诱导。在本研究中，研究人员测试了eATP巨胞饮在多种癌症类型中的普遍性，并确定了eATP诱导衰老的信号机制。通过定量ATP测量、体外和体内荧光成像、多种SA-β-Gal检测、衰老和巨胞饮的特异性通路抑制、转录组学和代谢组学分析，研究人员得出结论：eATP可在癌细胞中诱导双重且不同的机制。
**研究背景与问题提出**
肿瘤微环境中细胞外ATP（eATP）浓度显著升高，可达0.1–1 mM，由浸润免疫细胞和缺氧肿瘤细胞释放。在此浓度下，eATP作为应激与危险信号激活嘌呤能受体（PR），尤其是P2X7，调控上皮–间充质转化（EMT）、癌症干细胞（CSC）形成及耐药等多种肿瘤表型。与此同时，癌细胞通过巨胞饮（macropinocytosis）主动摄取细胞外营养物质，该过程在RAS驱动肿瘤等致癌环境中增强，对代谢适应具有重要贡献。研究人员此前已证实eATP可通过巨胞饮在肺癌和乳腺癌细胞中被内化，升高细胞内ATP（iATP）水平并激活促癌信号通路。细胞衰老作为一种应激响应状态，具有稳定细胞周期停滞和衰老相关分泌表型（SASP），虽历史上被视为抗癌机制，现已被认为具有情境依赖性且常促进癌症进展。基于eATP在PR信号传导与巨胞饮摄取中的双重既定作用，研究人员提出假设：eATP在癌细胞中发挥双重但不同的效应——巨胞饮介导的eATP内化与PR介导的衰老诱导，并在本研究中系统验证该假设。
**研究内容与结论**
研究人员通过定量ATP测量、体外及体内荧光成像、多种SA-β-Gal检测、通路特异性抑制、转录组学与代谢组学分析，得出以下结论：eATP通过巨胞饮在多种癌症类型中被广泛内化，快速升高iATP水平，且动力学特征因细胞系而异；巨胞饮抑制剂IPA3可剂量依赖性减少eATP诱导的iATP积累；STC1是NSCLC中巨胞饮ATP内化的关键调节因子；荧光标记ATP类似物与高分子量荧光葡聚糖（HMWFD）在体外和体内均共定位，直接证实巨胞饮介导的ATP内化；基于72基因巨胞饮特征计算的转录组评分（MScore）在肺腺癌（LUAD）和胰腺腺癌（PAAD）中具有预后意义；eATP诱导NSCLC细胞衰老，该效应由嘌呤能受体信号驱动而非依赖ATP摄取，巨胞饮抑制不影响衰老诱导。研究的重要意义在于揭示了eATP在肿瘤中作为信号分子和代谢燃料的双重角色，区分了两条平行的eATP响应通路，为靶向肿瘤微环境应激信号提供了新的理论框架。
**关键技术方法**
研究采用的主要技术方法包括：定量细胞内ATP检测（短时30–120分钟及长时2–4小时），使用多种癌细胞系（HT29、Panc1、MCF7、Skhep1、HOP92、H1299、A549等）及非致瘤性NL20细胞作为阴性对照；荧光显微镜体外成像，采用不可水解荧光ATP类似物（NHF-ATP）与HMWFD共定位验证巨胞饮摄取；裸鼠皮下移植瘤模型进行体内ATP内化验证；两种SA-β-Gal显色检测（手动计数法和X-gal荧光板读法）及流式细胞术检测衰老；TCGA-LUAD和TCGA-PAAD队列（通过cBioPortal获取）进行巨胞饮基因特征评分及生存分析；转录组学与代谢组学再分析。
**研究结果**
3.1 eATP在多种癌细胞系中升高iATP（短时研究）：通过30–120分钟eATP（0.25–0.75 mM）处理多种癌细胞系，发现eATP显著升高iATP，0.5 mM足以达到近最大效应，但时间进程因细胞系而异，提示摄取能力异质性。
3.2 eATP在体外以细胞系依赖方式升高iATP（长时孵育）：通过2–4小时延长孵育，发现部分细胞系持续升高（HT29、H1299），另一些则平台化（Panc1、HOP92、MCF7、Skhep1），证实eATP利用的巨胞饮能力差异。
3.3 巨胞饮抑制剂IPA3减少eATP诱导的iATP积累：通过IPA3（0–100 μM）剂量依赖性抑制实验，发现IPA3在多个细胞系中减少eATP诱导的iATP积累，但敏感性因癌种而异，支持巨胞饮对eATP驱动的iATP升高有实质性贡献。
3.4 STC1蛋白是NSCLC体外巨胞饮的关键调节因子：通过A549对照与STC1-KO细胞比较，发现长时暴露下STC1-KO细胞iATP积累显著减少，荧光显微镜显示NHF-ATP/HMWFD共定位定性减少，非致瘤性NL20细胞摄取极少，确定STC1为NSCLC巨胞饮ATP内化的重要调节因子。
3.5 荧光显微镜证实NHF-ATP与HMWFD在体外和体内癌细胞中共定位：通过共聚焦荧光显微镜及裸鼠肿瘤内注射实验，发现NHF-ATP与HMWFD在多种癌细胞系中呈 punctate 共定位，体内肿瘤模型亦显示不同程度共定位，直接证明巨胞饮是体外和体内ATP内化的普遍机制。
3.6 巨胞饮能力的临床验证与预后影响：通过TCGA泛癌图谱72基因巨胞饮特征评分，发现LUAD高MScore组总生存期显著缩短（P=0.009），PAAD队列显示高度显著且独特的代谢生存特征（P<0.001）；PAAD高MScore肿瘤中CDC42和RAC1适度但显著升高，SASP相关因子IL1A和CDKN1A显著升高而IL6显著降低，MMP1/MMP10/MMP3/STC1未达统计学显著性，提示MScore是LUAD和PAAD的预后标志物而SASP诱导为基因特异性而非通路整体现象。
3.7 eATP处理A549细胞后2–6小时衰老相关基因表达和代谢物谱的时间变异：通过再分析既往RNA-seq和代谢组学数据，发现eATP处理下衰老相关基因在早期（2小时）和晚期（6小时）时间点之间具有强时间一致性（Pearson R=0.87），而TGF-β处理显示弱时间一致性（R=0.08）；代谢物如NAD?、Gal-1-P和延胡索酸显示大幅变化，表明eATP诱导相对稳定的转录程序而代谢物经历更异质性重塑。
3.8 eATP诱导NSCLC细胞SA-β-Gal活性剂量和时间依赖性表达，从而诱导衰老，且嘌呤能受体信号介导eATP诱导的衰老独立于巨胞饮：通过两种互补SA-β-Gal检测和流式细胞术，发现eATP在A549和H1299细胞中时间依赖性诱导SA-β-Gal表达，SA-β-Gal在处理后2小时内即可观察升高，3–5小时下降，6小时后恢复并持续至少24小时；PR抑制剂oATP显著减少SA-β-Gal活性，而巨胞饮抑制剂IPA3不减少SA-β-Gal活性，表明eATP诱导的衰老主要由嘌呤能受体信号介导而非巨胞饮。
**讨论与结论**
癌细胞依赖机会性营养获取以维持升高的代谢需求，巨胞饮已成为支持营养清除、满足代谢需求和增强治疗耐药的主要途径。本研究扩展了既往发现，证明肿瘤微环境中高浓度的eATP通过巨胞饮在多种癌症类型中在体外和体内被广泛内化，导致iATP快速升高，其动力学和幅度因细胞系而异，与巨胞饮能力异质性一致。药理学抑制实验支持巨胞饮是eATP驱动iATP升高的主要贡献者，STC1缺失减少长时ATP积累和囊泡共定位，确定STC1为持续性巨胞饮ATP摄取的重要调节因子，而非致瘤性肺细胞摄取极少，强化了高巨胞饮活性主要为癌症相关表型。巨胞饮基因特征转录组评分显示与IPA3敏感性呈非显著正相关，并在特定癌症队列中显示预后关联。研究进一步发现eATP诱导NSCLC细胞衰老表型，由多种SA-β-Gal检测和流式细胞术支持，机制上主要由嘌呤能受体信号介导，P2X7为可能候选，oATP显著减少衰老诱导，而IPA3对衰老读数影响极小。这些数据区分了两条平行的eATP响应通路：巨胞饮依赖性ATP内化支持能量密集型表型如EMT、干性和耐药，以及嘌呤能受体信号驱动衰老 largely 独立于ATP摄取。衰老响应显示快速动态动力学，早期SA-β-Gal诱导随后部分下降和后期稳定，与既往观察到的eATP诱导EMT和CSC程序的早期时序平行。研究局限性包括eATP诱导衰老仅在NSCLC中研究，而巨胞饮介导的eATP摄取在更广泛癌种中测试，且衰老响应和SASP具有细胞或组织类型特异性，eATP诱导衰老有待在其他癌症类型中探索。总体而言，研究结果支持双重通路模型，即肿瘤水平eATP既作为巨胞饮营养来源又作为嘌呤能信号配体，巨胞饮和衰老诱导似乎是两个不同机制，联合靶向是否可限制侵袭性肺和胰腺恶性肿瘤的临床进展尚待探索。
