《Biosensors and Bioelectronics》：Ultrasensitive direct detection of HMGB1 protein via covalently modified graphene field-effect transistors.
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高迁移率组盒1蛋白（HMGB1）是一种核染色质结合蛋白，在细胞应激或坏死过程中可释放至细胞外环境，或被主动分泌，在胞外作为早期促炎介质，参与广泛的炎症性和自身免疫性疾病。因此，胞外HMGB1是涉及坏死或广泛组织损伤的健康状况的理想临床生物标志物。本研究开发并表
高迁移率组盒1蛋白（HMGB1）是一种核染色质结合蛋白，在细胞应激或坏死过程中可释放至细胞外环境，或被主动分泌，在胞外作为早期促炎介质，参与广泛的炎症性和自身免疫性疾病。因此，胞外HMGB1是涉及坏死或广泛组织损伤的健康状况的理想临床生物标志物。本研究开发并表征了一种共价修饰的石墨烯场效应晶体管（CG-FET）生物传感器，该传感器整合DNA适配体，用于HMGB1蛋白的超灵敏检测。器件采用市售抗HMGB1 DNA适配体制备，其连续功能化步骤通过微粒子诱发X射线发射（μ-PIXE）独立验证。通过电学测量监测功能化过程及HMGB1结合过程中石墨烯狄拉克点的变化。该传感器展现出清晰且可重复的分析性能，可在阿托摩尔（attomolar）范围内实现对目标蛋白的检测限（LoDs）。特异性研究确认了适配体–HMGB1的选择性识别，并证明优化缓冲液条件可减少非特异性相互作用。上述结果展示了基于市售适配体的CG-FET生物传感器的性能，并为其在复杂生物基质中的进一步开发与验证、迈向潜在诊断应用奠定了基础。
论文解读：基于共价修饰石墨烯场效应晶体管的HMGB1蛋白超灵敏检测研究
一、研究背景与问题
高迁移率组盒1蛋白（HMGB1）是一种高度保守、广泛表达的非组蛋白核蛋白，生理条件下参与染色质组织、DNA修复、基因转录及细胞应激反应。当细胞活化、损伤、坏死或受免疫刺激时，HMGB1从细胞核转位至细胞质并释放至胞外。释放至胞外的HMGB1作为损伤相关分子模式（DAMP）或警报素，持续并放大炎症级联反应。异常的胞外HMGB1表达已被证实在多种炎症性和自身免疫性疾病中发挥作用，包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、脓毒症、癫痫及多种癌症，以及包括某些眼科疾病在内的多种神经退行性疾病。因此，胞外HMGB1被视为有前景的临床生物标志物。
传统生化方法在血清等复杂生物液体中检测HMGB1的可靠浓度约为1 pg μL?1，在成分较简单的样本中可实现更低检测限。然而，现有检测技术在灵敏度、特异性及临床适用性方面仍存在局限。石墨烯基传感器在液体环境中工作构成强大的生物传感平台，分析物可在溶液中自由扩散并与固定在石墨烯表面的识别元件相互作用。石墨烯溶液栅控场效应晶体管（G-FET）结合体外筛选适配体作为探针的研究日益受到关注。然而，传统非共价功能化策略虽常被采用，但共价化学修饰可能向石墨烯晶格引入大量缺陷，降低其电学性能。此外，现有适配体技术通常依赖通过指数富集配体系统进化（SELEX）流程专门设计的适配体，成本高、开发周期长。本研究旨在开发一种基于共价修饰石墨烯场效应晶体管（CG-FET）的生物传感器，利用市售适配体实现HMGB1的超灵敏、高选择性检测，降低实现门槛并推动即时检测（PoC）应用。
二、研究内容与主要技术方法
研究人员采用Graphenea公司生产的mini-GFET-4D芯片（4 mm × 4 mm），包含28个石墨烯通道、7个单通道晶体管和7个三通道晶体管。器件功能化流程包括：丙酮浸泡过夜及异丙醇清洗；十二烷基硫醇（DDT）处理以防止电极表面非特异性吸附；在超高真空条件下通过低能Ar?辐照产生单原子空位，随后用对氨基苯硫酚（p-ATP）分子退火实现共价功能化；将5'端硫醇修饰的抗HMGB1适配体通过二硫键共价固定于p-ATP修饰的石墨烯表面。研究采用微粒子诱发X射线发射（μ-PIXE）对各功能化阶段进行独立元素验证，通过电学测量监测狄拉克点（CNP）位移评估传感性能，并采用间接比色酶联寡核苷酸分析（ELONA）评估适配体对不同蛋白的结合亲和力与特异性。
三、研究结果
3.1 空间元素分布与μ-PIXE图谱定性分析
研究人员利用μ-PIXE对器件不同功能化阶段进行元素组成分析。在原始器件中，中心金电极区域检测到硅（来自衬底）、铬（电极下方）和金（电极组成），未检测到硫和磷。DDT处理后，仅在暴露的金电极表面检测到硫信号，封装金电极和石墨烯通道区域无硫信号，证实DDT分子选择性吸附于暴露金表面，可有效防止后续传感过程中的非特异性蛋白吸附。在完成石墨烯功能化、适配体孵育和蛋白结合的最后阶段，石墨烯通道区域同时检测到硫和磷信号。磷信号来源于适配体磷酸二酯骨架中的多个磷原子，硫信号可能来源于HMGB1蛋白含硫残基、适配体及p-ATP连接分子。该结果提供了适配体功能层及HMGB1暴露后最终表面组成的定性元素证据。
3.2 HMGB1蛋白的阿托摩尔检测
研究人员通过监测源漏电流随栅极电压的变化获得转移曲线，比较HMGB1蛋白暴露前后的响应。在器件功能化各阶段（原始、p-ATP共价功能化后、适配体孵育后、HMGB1蛋白孵育后），转移曲线显示狄拉克点逐步位移，输出曲线显示电导变化。HMGB1蛋白浓度从10?1? M至10?12 M范围内，转移曲线显示石墨烯连续p掺杂，狄拉克点向正值方向移动。剂量-响应曲线拟合得到统计检测限（LoD）为4.29 aM，在10?1? M至10?1? M范围内响应曲线近似线性，灵敏度为20 ± 3 mV/十倍浓度。该结果代表每个传感器中14个晶体管的平均响应，误差棒表示芯片内各晶体管通道间的变异性。研究在另外10个器件（共140个晶体管）上验证了响应可重复性，支持该适配传感器满足诊断应用的关键要求：高且可重复的灵敏度。
3.3 特异性测试
比色ELONA亲和力测试显示，适配体对二硫化物形式HMGB1（dHMGB1）的亲和力高于完全还原形式（rHMGB1），因此后续性能评估选用dHMGB1。概念验证特异性测试包括：使用非特异性ssDNA分子D-ACTG替代抗HMGB1适配体孵育HMGB1蛋白，狄拉克点仅产生2.5 mV的微小变化，证明HMGB1蛋白与非特异性DNA分子无结合；将抗HMGB1适配体与HCV核心蛋白孵育，狄拉克点变化可忽略，证明适配体对HCV核心蛋白无识别。缓冲液循环测试同样产生可忽略的狄拉克点位移，排除仪器漂移或迟滞效应的影响。
更严格的特异性测试以人血清白蛋白（HSA）和人溶菌酶为靶蛋白进行ELONA分析。适配体在pH 7.6-9范围内对人溶菌酶表现出可忽略的亲和力。然而，当适配体在PBSMg缓冲液中制备时，对HSA的Kd和Bmax值与dHMGB1相当，表明存在非特异性结合。当适配体在Tris-HCl缓冲液中制备时（pH 7.6-9范围内），对HSA的非特异性结合几乎消失。研究人员对此进行了解释：实验条件下HSA和抗HMGB1适配体均携带净负电荷，PBSMg的高离子强度有效屏蔽静电排斥力，促进适配体-HSA的非特异性相互作用；而Tris-HCl缓冲液的离子屏蔽作用减弱，保留静电排斥力，抑制非特异性结合并有利于适配体对HMGB1的特异性识别。
将适配体改用Tris-HCl缓冲液制备后，传感器检测dHMGB1蛋白（浓度10?1? M至10?12 M，蛋白仍以PBSMg稀释），狄拉克点随浓度增加向正值方向移动，统计LoD约为32.4 aM，灵敏度为11 ± 2 mV/十倍浓度。
四、讨论与结论
研究结果表明，基于市售适配体的CG-FET生物传感器可在缓冲条件下实现HMGB1蛋白的阿托摩尔级超灵敏检测，LoD分别为PBSMg中的4.29 aM和Tris-HCl中的32.4 aM，对应约0.11-0.81 fg mL?1，比传统复杂液体检测方法低数个数量级。μ-PIXE提供了各功能化步骤的独立元素验证，电学测量显示与HMGB1识别相关的可重复狄拉克点位移。特异性研究证实了传感策略的选择性，并强调缓冲液组成在最小化非特异性相互作用中的关键作用。适配体对dHMGB1的优先亲和力具有重要生物学意义，因为dHMGB1被广泛认为是HMGB1驱动炎症信号的主要介质，与组织损伤、炎症活动及疾病严重程度更密切相关。该平台可能比检测总HMGB1而不区分氧化还原状态的常规方法具有显著优势，可增强HMGB1检测的临床特异性和诊断相关性。该研究确立了所提出平台在受控条件下的概念验证，虽然在临床相关生物基质和患者来源样本中的验证仍属必要，但当前发现为向PoC应用方向的进一步开发提供了坚实基础。该论文发表于《Biosensors and Bioelectronics》。
