高渗渗透效应、离子功能与表达网络揭示巨石斑鱼（Epinephelus lanceolatus）精子激活和运动的生理与多组学机制

《Aquaculture Reports》：Physiological and multi-omics analyses reveal osmotic effect, ionic function, and expression network underlying sperm activation and movement in giant grouper ( Epinephelus lanceolatus)

　　

精子激活和运动是海洋硬骨鱼类繁殖成功的基础，但其机制在珊瑚礁鱼类中仍大部分未阐明。巨石斑鱼（Epinephelus lanceolatus）是最大的珊瑚礁鱼类和具有重要水产养殖价值的物种，因成熟功能性雄鱼稀缺及受精效率欠佳而面临繁殖限制。本研究整合精子活力分析（sperm motility analysis）与转录组学（transcriptomics）和蛋白组学（proteomics）谱分析，以表征巨石斑鱼精子激活和运动相关的生理响应及候选分子过程。活力分析显示，高渗暴露启动精子运动，而含Na⁺、K⁺和Ca²⁺的激活介质影响运动表现；K⁺产生相对较高比例的快速运动精子，提示其在运动调控中具有重要作用。转录组学和蛋白组学分别鉴定出1235个差异表达基因（DEGs）和1100个差异表达蛋白（DEPs）。多组学分析揭示与电压依赖性Ca²⁺通道（VDCCs）、超极化激活环核苷酸门控通道（HCN channels）及Na⁺/Ca²⁺通透性受体（Na⁺/Ca²⁺-permeable receptors）相关的转录本和蛋白丰度改变，提示激活后状态涉及膜电位依赖性离子信号。与胰岛素/胰岛素样生长因子1-叉头框（Insulin/IGF1-FOXO）信号相关的基因和蛋白表达模式提示该通路在激活后参与度降低，而与丙酮酸代谢、三羧酸循环（TCA cycle）、乳酸代谢和脂肪酸降解相关分子的变化与线粒体氧化代谢参与度增加相一致。本研究提供巨石斑鱼精子激活和运动的生理与分子见解，并为海洋水产养殖中优化激活介质和精子利用策略提供基础。

论文主体解读：巨石斑鱼（Epinephelus lanceolatus）是最大的珊瑚礁鱼类，兼具生态关键性和重要水产养殖价值，但商业育苗受成熟雄性亲鱼短缺、受精效率欠佳和苗种供应不足制约。精子激活和运动是繁殖成功的基础，海洋硬骨鱼多由高渗环境触发激活，Na⁺、K⁺和Ca²⁺参与运动调控，但珊瑚礁鱼类的机制仍不清楚，限制了激活介质和精子利用策略优化。为此，研究人员整合精子活力评估、转录组学和蛋白组学，比较激活后精子与新鲜精子的生理与分子差异，并测试渗透压及离子效应。研究得出：高渗条件启动精子运动，离子组成进一步影响运动表现，K⁺提高快速运动精子比例；多组学提示激活后涉及VDCCs、HCN channels和Na⁺/Ca²⁺通透性受体相关离子信号，Insulin/IGF1-FOXO信号参与降低，线粒体氧化代谢相关通路参与增加。该研究为巨石斑鱼精子激活机制提供生理与分子依据，并为优化激活介质和海水养殖精子利用提供基础。

技术方法概括：样本取自Daya Bay Fisheries Development Center的3尾性成熟雄鱼（体质量>35 kg、全长>100 cm、年龄>7年），筛选初始活力>85%且无血液、尿液或粪便污染的精液。作者采用综合精子分析系统（ISAS v2.0）评估活力，在500–1500 mOsm/kg及20、180、300 s测试蔗糖、人工海盐、NaCl、KCl、CaCl2及离子组合；以自然过滤海水激活600 s为激活精子（AS）、新鲜精子为对照（FS）。开展RNA测序（RNA-seq；Illumina NovaSeq 6000）和蛋白组数据独立采集液相色谱-串联质谱（DIA LC-MS/MS；Orbitrap Astral），并结合主成分分析（PCA）、差异表达基因/蛋白（DEGs/DEPs）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）/基因本体（GO）、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）及mRNA-通路-蛋白网络分析。

研究结果：3.1 渗透压对精子运动的影响：通过人工海盐和蔗糖在500–1500 mOsm/kg、激活后20/180/300 s评估，700–1200 mOsm/kg可维持较好活力；1000 mOsm/kg、20 s时人工海盐的快速运动（A+B）比例显著高于蔗糖，提示离子效应对激活的贡献。3.2 离子对精子运动的影响：以NaCl、KCl、CaCl2梯度评估，1000 mOsm/kg、20 s时KCl处理的快速运动比例较高、弱运动（C级）比例较低，提示K⁺在运动调控中作用突出。3.3 联合离子对精子运动的影响：在1000 mOsm/kg下测试不同摩尔比，NaCl与KCl 3:1和1:1维持高活力，且3:1、1:1、1:3富集快速运动；KCl与CaCl2 7:1增加快速运动；NaCl与CaCl2 3:1、1:1、1:3促进快速运动。3.4.1 RNA-seq摘要、DEGs和PPI：6个样本测序，clean reads占96.57%，Q20>97%、Q30>93%，可比对参考基因组；组装28,798个基因；PCA显示AS与FS分离；鉴定1235个DEGs（811个上调、424个下调），包括cftr、itpr3、hcn2b、hcn4、cacna1c、cacna1ea、grin2db、grin1b、gria4b；PPI网络识别RPS9和RPL3为枢纽基因。3.4.2 DEGs的KEGG和GO富集：KEGG有12条通路显著富集，上调DEGs富集于pyruvate metabolism，下调DEGs富集于insulin signaling pathway和FoxO signaling pathway；GO有79项显著富集，上调于非膜结合细胞器和有机氮化合物生物合成过程，下调于信号转导调控和胞内信号转导。3.5.1 蛋白组：鉴定5557个蛋白、47,159个肽段；1100个DEPs（306个上调、794个下调）；PPI识别RPS18、RPL23A、RPS3、RPL11和CS为枢纽蛋白。3.5.2 DEPs的KEGG和GO富集：20条通路显著富集且多为代谢相关，上调DEPs富集于carbon metabolism、TCA cycle、pyruvate metabolism和fatty acid degradation，下调DEPs富集于ribosome；GO有85项显著富集，上调于ATPase regulator activity、代谢过程、氧化还原过程和羧酸代谢过程，下调于胞内非膜结合细胞器调控、嘌呤核苷酸结合和蛋白结合。3.6.1 mRNA-通路-蛋白网络：以6条关键KEGG通路、41个DEGs和50个DEPs构建网络，识别IDH3、HK2和RPS6等转录本与蛋白同时变化分子。3.6.2 精子激活和运动的关键基因与蛋白：筛选19个基因和22个蛋白；激活后itpr3、cftr、insrb、cblb、cbl、trip10a、irs4b、pik3r3b、igf1ra、hk、acsl3b转录本丰度下降，cacna1c、cacna1ea、grin2db、grin1b、gria4b、hcn2b、hcn4、pgk1、bpgm、pklr、idh3、ehhadh上升；蛋白IRS2、HK2、LDHA、LDHB下降，ME2、ME3、PC、PDHA、CS、ACO、IDH2、IDH3、FH、MDH、CPT2、ECHS1、HADH上升，并构建候选转录组-蛋白组表达网络。

讨论总结：4.1 渗透压和离子效应：巨石斑鱼在高于精浆渗透压（427–438 mOsm/kg）的700–1200 mOsm/kg范围内激活良好，符合海洋硬骨鱼高渗激活模式；多离子溶液活力高于无离子蔗糖，说明离子组成关键；K⁺显著增加快速运动精子，可能经HCN2/4及K⁺/Na⁺ ATPase通道参与；Na⁺通过pH调节、膜电位及反向Na⁺/Ca²⁺交换等参与，Ca²⁺可增强运动，但无离子介质亦可启动，提示初始激活不依赖细胞外Ca²⁺；Na⁺与K⁺或Ca²⁺在3:1、1:1、1:3比例下具协同作用。4.2.1 Na⁺、K⁺和Ca²⁺信号：激活后itpr3下调提示内质网Ca²⁺释放贡献降低，VDCCs和N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDARs）相关基因上调、HCN channels相关基因上调及cftr、gria4b变化提示膜电位依赖性离子信号参与。4.2.2 信号转导与能量代谢：Insulin/IGF1-FOXO相关基因和IRS2下调提示该通路参与降低；HK下调但pgk1、bpgm、pklr上调，LDH下调而PDHA、PC、ME2/ME3上调，TCA cycle及脂肪酸降解相关蛋白上调，提示激活后线粒体有氧代谢参与增加。4.3 水产意义、组学局限与前景：约1000 mOsm/kg及适宜离子比例可为激活介质优化提供依据；600 s取样反映激活后整体状态；成熟精子转录活性有限，RNA-seq主要反映poly(A)⁺转录本丰度变化；候选网络仍需抑制剂、电生理、离子成像、膜电位、ATP（三磷酸腺苷）定量、免疫细胞化学、Western blotting及受精和孵化试验验证。

结论翻译：本研究通过精子活力评估、转录组学和蛋白组学整合分析，表征了巨石斑鱼精子在高渗激活下的生理响应和候选分子过程。研究结果显示，超过精浆渗透压的高渗条件为精子激活提供最佳环境，这与海洋硬骨鱼精子激活的一般模式一致。离子组成进一步提高精子活力，Na⁺、K⁺和Ca²⁺单独及共同影响运动表现。K⁺显著增加快速运动精子比例，突出其在激活启动中的重要作用，而Na⁺和Ca²⁺通过与其他离子相互作用参与运动调控。整合转录组和蛋白组分析表明，激活后离子响应涉及膜去极化相关离子通道活性，包括VDCCs、HCN channels和Na⁺/Ca²⁺通透性受体。Insulin/IGF1-FOXO信号通路和代谢通路的表达变化表明激活后代谢重塑，以上游糖酵解活性降低和线粒体氧化通路参与增加为特征。与丙酮酸代谢、TCA cycle、乳酸代谢和脂肪酸降解相关的基因和蛋白表达改变提示线粒体能量代谢对维持精子运动具有潜在贡献。总体而言，巨石斑鱼精子激活和运动是涉及高渗信号、协调离子信号、细胞内调控和代谢重塑的整合响应。这些发现为巨石斑鱼精子激活和运动机制提供生理和分子见解，并为优化激活介质和海洋水产养殖精子利用策略奠定基础。