人脐带间充质干细胞来源外泌体通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路缓解大鼠子宫内膜损伤

《Cell Transplantation》：Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes alleviate endometrial injury rats by suppressing the HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathway

　　

子宫内膜损伤是宫腔粘连（IUA）的主要病因，失调的炎症信号促进纤维化和功能障碍。人脐带间充质干细胞来源外泌体（hUCMSC-Exos）显示出子宫内膜修复潜力，但其分子机制尚不明确。本研究分离并鉴定了hUCMSCs和hUCMSC-Exos。研究人员发现，hUCMSC-Exos移植通过恢复子宫内膜厚度、增加腺体数量、减轻炎症和纤维化以及上调增殖标志物表达，有效逆转了大鼠子宫内膜损伤。此外，hUCMSC-Exos增强了子宫内膜基质细胞（ESCs）的增殖，降低了促炎细胞因子水平，并增加了抗炎/抗纤维化因子的表达。机制研究证实，hUCMSC-Exos显著下调HMGB1、TLR4和NF-κB的mRNA表达，同时上调IκBα mRNA。同时，hUCMSC-Exos抑制了HMGB1、TLR4、p-IκBα和p-p65的蛋白表达及磷酸化，上调了IκBα蛋白。此外，丙酮酸乙酯（EP）和吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（PDTC）增强了hUCMSC-Exos介导的对上述通路分子表达及磷酸化的抑制作用，而重组高迁移率族蛋白B1（rHMGB1）则显著逆转了这种抑制作用。结果表明，hUCMSC-Exos可能通过HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路调节炎症，提示该通路在子宫内膜损伤修复中的潜在作用。

研究背景：子宫内膜基底层严重损伤或感染可触发过度、失控的炎症反应，进一步促进宫腔粘连（IUA）形成与进展。IUA以宫腔部分或完全闭锁为病理特征，随着临床子宫操作（尤其人工流产后刮宫）日益增多，其发病率逐年上升，常导致月经过少、复发性流产及不孕，严重危害女性生殖健康。经宫颈粘连切除术（TCRA）仍是IUA一线临床干预手段，但手术创伤本身可诱导二次损伤和粘连再形成，术后复发率高达62.5%，满意妊娠率仅22.5%～33.3%。现有术后管理主要依赖宫腔球囊、Foley导管和透明质酸（HA）凝胶等物理屏障重建宫腔通畅、覆盖裸露区域并防止粘连进展，但这些刚性装置常引发无菌性炎症和不适，亟需创新有效的治疗策略。近年来，干细胞治疗成为修复受损子宫内膜的潜在途径，间充质干细胞（MSCs）因其高可及性、低免疫原性和强抗炎能力而备受关注。越来越多证据表明，MSCs的治疗效应主要并非通过直接分化为靶细胞介导，而是通过涉及生物活性因子分泌的旁分泌机制调控受损微环境、促进组织再生与修复。外泌体是直径约30～100 nm的细胞外囊泡（EVs）亚型，可转运mRNAs、microRNAs（miRNAs）、蛋白质和脂质等生物活性成分至靶细胞，调节细胞增殖、凋亡、迁移、免疫炎症反应及血管生成等。作为干细胞的关键效应载体，外泌体通过转移miRNA调控靶基因表达并重塑局部微环境来介导组织修复。越来越多研究证实MSC来源外泌体（MSC-Exos）对子宫内膜修复至关重要，其中hUCMSC-Exos治疗潜力尤为突出。既往研究主要关注TGF-β1/Smad通路作为逆转上皮-间质转化（EMT）和减轻纤维化的靶点，但少有研究涉及炎症在IUA发生中的核心作用。事实上，炎症是子宫内膜损伤的病理基础，持续炎症信号诱导巨噬细胞向促纤维化表型极化，最终形成促进IUA患者子宫内膜纤维化进展的微环境。高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是一种高度保守的核蛋白和关键损伤相关分子模式（DAMP），连接组织损伤与炎症反应。在机械创伤和炎症应激等病理刺激下，HMGB1从细胞核转位至细胞质，并被单核/巨噬细胞主动分泌或于细胞死亡时被动释放。细胞外HMGB1通过与Toll样受体4（TLR4）等模式识别受体（PRRs）相互作用激活下游炎症信号。作为HMGB1的关键受体，TLR4介导HMGB1诱导的NF-κB活化。本研究旨在探究hUCMSC-Exos是否通过调控HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路缓解IUA相关子宫内膜损伤。研究人员首先分离并鉴定了hUCMSCs及其外泌体，随后通过机械损伤联合LPS诱导构建大鼠子宫内膜损伤模型，模型大鼠接受腹腔及尾静脉注射hUCMSC-Exos治疗2周，评估其对子宫内膜形态、HMGB1表达及生育相关参数的治疗效果；进一步将LPS诱导的ESCs与hUCMSC-Exos共孵育进行体外分析；最后通过上调/下调HMGB1和NF-κB表达验证hUCMSC-Exos在HMGB1/TLR4/NF-κB轴中的调控作用，阐明HMGB1作为子宫内膜损伤新型治疗靶点的潜力。研究结论表明，hUCMSC-Exos改善子宫内膜损伤，伴随炎症减轻和子宫内膜再生恢复，观察结果提示HMGB1/TLR4/NF-κB信号轴参与这些保护效应，这些发现指向hUCMSC-Exos作为IUA候选治疗剂，并将HMGB1标记为子宫内膜修复中值得关注的研究分子，为后续外泌体相关临床前研究提供了相关性实验数据。

主要关键技术方法：研究人员采用组织块贴壁法培养hUCMSCs并通过流式细胞术鉴定表面标志物（CD34、CD45、CD90、CD105）；通过差速离心法从无血清培养上清中提取hUCMSC-Exos，并采用透射电镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和蛋白质印迹（WB）检测CD9、CD63、CD81及Calnexin进行鉴定；建立SD大鼠子宫内膜机械损伤联合LPS感染双重损伤模型（Sprague-Dawley大鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司），并设置EP（HMGB1抑制剂）、PDTC（NF-κB抑制剂）和rHMGB1（HMGB1上调剂）干预组；体外采用LPS诱导大鼠子宫内膜基质细胞（ESCs，购自Procell）炎症模型；通过H&E染色、Masson染色、免疫组化（IHC）、TUNEL染色、酶联免疫吸附测定（ELISA）、qRT-PCR和WB检测组织形态、细胞凋亡、细胞因子水平及通路分子表达；采用CCK-8法检测细胞增殖活性。

研究结果：（1）hUCMSCs及hUCMSC-Exos的提取与鉴定：倒置显微镜下P3代hUCMSCs呈纺锤形旋涡状排列，流式细胞术显示CD90?（97.8%）和CD105?（97.4%）高表达，CD34?（2.75%）和CD45?（0.07%）低表达，符合国际细胞与基因治疗学会（ISCT）标准；TEM显示外泌体呈圆形或椭圆形膜性囊泡，NTA显示峰值直径123.8 nm，WB证实CD9、CD63、CD81在Exos样本中阳性表达而Calnexin低表达，成功鉴定hUCMSC-Exos。（2）hUCMSC-Exos有效修复刮宫联合LPS诱导的大鼠子宫内膜损伤：H&E染色显示模型组子宫内膜厚度和腺体数量显著减少、炎性细胞浸润增加，hUCMSC-Exos治疗显著增加宫腔体积、增厚子宫内膜、提高腺体密度并减少炎性细胞浸润；Masson染色显示模型组胶原沉积显著增加，Exo组胶原沉积显著降低；TUNEL染色显示模型组凋亡细胞显著增多，hUCMSC-Exos治疗显著抑制细胞凋亡。（3）hUCMSC-Exos显著促进子宫内膜细胞再生、血管生成及子宫内膜容受性：IHC显示模型组CK-19、Vimentin、VEGF和ERα表达均显著降低，hUCMSC-Exos治疗显著上调上述标志物表达，表明其通过上调CK-19促进子宫内膜再生、通过上调Vimentin促进基质修复、通过上调VEGF促进血管生成、通过上调ERα改善子宫内膜容受性。（4）hUCMSC-Exos调控炎症因子释放：ELISA显示模型组血清IL-1β、IFN-γ、IL-6、TNF-α和TGF-β显著升高，IL-4和IL-10显著降低；hUCMSC-Exos治疗显著降低促炎因子和TGF-β水平，恢复抗炎因子IL-4和IL-10表达，表明其通过靶向调控细胞因子网络减轻炎症并抑制纤维化。（5）体外验证hUCMSC-Exos治疗效果：CCK-8显示LPS诱导显著降低ESC增殖活性，外泌体以时间依赖性方式有效逆转此损伤，72 h疗效最强；qRT-PCR显示模型组CK-19、Vimentin、VEGF和ERα mRNA显著降低，hUCMSC-Exos治疗后CK-19、Vimentin和ERα mRNA显著上调（VEGF无统计学差异但数值升高）；ELISA显示hUCMSC-Exos有效纠正炎症细胞因子失衡。（6）hUCMSC-Exos通过HMGB1-TLR4-NF-κB通路改善大鼠子宫内膜损伤：qPCR显示模型组HMGB1、TLR4和NF-κB mRNA显著升高、IκBα显著降低，hUCMSC-Exos治疗有效逆转；EP或PDTC干预进一步显著降低HMGB1、TLR4和NF-κB表达并恢复IκBα水平，而rHMGB1显著逆转上述效果（对IκBα无统计学差异）；WB显示模型组HMGB1、TLR4、p-IκBα和p-p65蛋白显著升高、IκBα显著降低，hUCMSC-Exos治疗显著降低上述蛋白并上调IκBα，EP/PDTC进一步下调HMGB1、TLR4和p-IκBα（p-p65呈非显著下降趋势），rHMGB1显著升高HMGB1、TLR4、p-IκBα和p-p65（IκBα下降无统计学意义），NF-κB p65总蛋白各组间无显著差异。

讨论部分总结：IUA（Asherman综合征）是基底层损伤导致宫腔部分或完全闭锁的常见妇科疾病，多由机械创伤诱发并因合并感染而加重。MSC治疗虽在动物模型中取得疗效但不孕发生率仍高，MSC来源外泌体具有与MSCs相当的生物学特性及低免疫原性和非致瘤性优势。本研究系统探究了hUCMSC-Exos对机械创伤联合LPS感染诱导的子宫内膜损伤的治疗效果及机制，数据表明HMGB1/TLR4/NF-κB通路可能参与hUCMSC-Exos的抗炎、抗纤维化和组织修复作用。hUCMSC-Exos移植逆转病理病变并恢复组织功能：H&E显示子宫内膜厚度和腺体密度增加，恢复激素依赖性分泌能力；Masson显示胶原沉积显著减少、抑制病理性纤维化、重建疏松基质结构；炎性浸润明显减轻。生物标志物分析证实子宫内膜结构和功能的双重恢复：CK-19上调表明上皮再生和屏障分泌功能恢复，Vimentin升高反映基质细胞增殖活化，VEGF增加促进血管网络重建，ERα恢复保证子宫内膜对雌激素的响应性和植入窗形成，TUNEL证实hUCMSC-Exos显著抑制子宫内膜细胞凋亡。hUCMSC-Exos重塑损伤后炎症微环境：下调IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ，上调IL-4和IL-10，抑制TGF-β表达。研究进一步确定HMGB1/TLR4/NF-κB信号轴是介导hUCMSC-Exos修复效应的核心分子级联：动物模型中该通路被强烈激活，hUCMSC-Exos联合EP或PDTC产生协同通路抑制并增强子宫内膜修复，而外源性rHMGB1消除hUCMSC-Exos的治疗益处并加重炎症和纤维化表型，hUCMSC-Exos联合PDTC取得最佳治疗效果，提示靶向该通路汇聚节点可最大化疗效。与既往主要关注TGF-β1/Smad抗纤维化策略的研究不同，本研究强调炎症作为核心病理驱动因素并确定HMGB1作为连接炎症与纤维化的枢纽分子，证实hUCMSC-Exos通过靶向HMGB1中断炎症-纤维化串扰。研究局限性包括：动物模型仅再现急性子宫内膜损伤而非慢性复发性IUA，仅评估治疗后14天缺乏长期随访；未进行蛋白质组学和miRNA分析，HMGB1通路抑制的生物活性分子尚未鉴定；未进行基因过表达或敲低实验，缺乏反向功能验证；治疗结果仅在组织和分子水平评估，缺乏植入率、妊娠率和产仔数等功能验证。