火木层孔菌遗传转化与荧光蛋白表达体系的建立

《Fungal Biology and Biotechnology》：Genetic transformation and fluorescent protein expression in the biomaterial-producing fungus Fomes fomentarius

　　

摘要 背景：基于真菌的材料目前被研究作为建筑、包装、纺织和时尚工业中化石基材料的可再生和可持续替代品。多孔菌火木层孔菌（Fomes fomentarius）能够利用多种植物残余物流生产一系列轻质、耐用且柔韧的材料。对该真菌进行遗传工程改造无论从基础研究角度还是优化火木层孔菌材料的性能特征而言，都是一个重要的技术目标。 结果：研究人员提供了火木层孔菌可以进行遗传转化的原理验证。使用标准方案，菌丝可产生大量原生质体。这些原生质体通过诺尔丝菌素（nourseothricin）筛选和诺尔丝菌素N-乙酰转移酶抗性标记（natR）进行了转化。利用火木层孔菌翻译延伸因子启动子成功实现了* natR 的表达。通过诊断性PCR和Southern印迹法证实了外源表达盒与受体基因组的稳定、多拷贝和非靶向整合。然而，基于基因组编辑破坏假定的 ku70 编码基因的初步尝试未获成功。研究人员利用裂褶菌（Schizophyllum commune*）H2B启动子，通过qRT-PCR和荧光显微镜验证了两种荧光蛋白的表达。这些数据证实了mCherry和eGFP在火木层孔菌中的功能性，并表明这些蛋白可用于未来的蛋白质定位研究。最后，研究人员报道了火木层孔菌中存在DNase活性，并假设这可能是该真菌遗传转化面临的一个重大技术挑战。 结论：利用本研究开发的启动子、标记物和诺尔丝菌素筛选系统，火木层孔菌可以进行遗传转化。eGFP和mCherry的表达是利用荧光显微镜进行细胞生物学和基因功能分析的重要一步。研究人员为过表达研究奠定了基础，此外，还确定了在这种重要的产材真菌中进行靶向基因工程需克服的几个挑战。

火木层孔菌遗传转化与荧光蛋白表达体系建立的研究解读

一、研究背景与意义

随着全球对可持续发展需求的日益增长，基于真菌的生物材料因其可再生性和环境友好性，被视为传统化石基材料（如塑料、泡沫等）的理想替代品，广泛应用于建筑、包装、纺织和时尚等领域。其中，多孔菌火木层孔菌（Fomes fomentarius）作为一种白腐担子菌，能够高效定殖于多种植物残余基质，并生产出轻质、耐用且柔韧的复合材料、泡沫和纸张等。尽管其材料应用潜力巨大，但对其在复合材料形成过程中的基础生物学认知仍十分有限，尤其是在分子遗传学层面。为了深入理解其生物学机制并优化材料性能，建立该真菌的遗传转化体系成为一项迫切且重要的技术目标。此前，在其他产材真菌如裂褶菌（Schizophyllum commune）、平菇（Pleurotus ostreatus）和灵芝（Ganoderma lucidum）中，已有成功的遗传工程案例，包括疏水蛋白、漆酶及转录因子等功能基因的研究。然而，针对火木层孔菌，尚无遗传转化的报道。因此，本研究旨在首次建立火木层孔菌的遗传转化方法，为其功能基因组学和材料性能优化奠定基础。

二、关键技术方法

为实现上述目标，研究人员采用了原生质体介导的转化方法，使用多酶混合物VinoTaste^? Pro制备火木层孔菌的原生质体。通过诺尔丝菌素（nourseothricin）筛选系统和诺尔丝菌素N-乙酰转移酶抗性标记（natR）进行阳性克隆筛选。利用模块化克隆（MoClo）技术和Gibson组装方法构建了一系列表达载体。采用诊断性PCR和Southern印迹法验证外源DNA的整合。使用qRT-PCR和荧光显微镜评估荧光蛋白的表达。此外，还通过凝胶电泳检测了菌株的DNase活性。

三、研究结果

1. 火木层孔菌的转化

研究人员首先证明了火木层孔菌能够产生大量原生质体。通过将携带* natR 基因的质粒pHom2转化原生质体，获得了抗诺尔丝菌素的转化子，证实了该筛选系统的可行性。随后，利用火木层孔菌自身的翻译延伸因子（tef1）启动子驱动 natR 表达，构建了质粒pMC_2_90。将该质粒的线性化片段与CRISPR/Cas12a核糖核蛋白复合物共同转化，成功获得了多个抗性转化子。诊断性PCR确认了 natR 基因的存在，而Southern印迹分析则揭示了外源表达盒在受体基因组中的稳定、多拷贝和非靶向整合。然而，针对 ku70 *基因的敲除尝试并未成功。生长实验显示，不同转化子的菌落形态和径向生长速率存在差异，其中多拷贝整合频率最高的菌株JZ90.9表现出最显著的生长缺陷。

2. 荧光蛋白标记

研究人员构建了分别表达H2B-eGFP和H2B-mCherry融合蛋白的质粒pMC_2_115和pMC_2_116。通过转化和筛选，获得了多个抗性克隆。qRT-PCR分析表明，部分克隆成功表达了H2B及相应的荧光蛋白基因，表达水平约为内参肌动蛋白的10%-30%。荧光显微镜观察进一步证实，在转化子的菌丝中，eGFP和mCherry均能在细胞核中观察到清晰的点状荧光信号，而野生型对照的自发荧光极低。这表明两种荧光蛋白在火木层孔菌中功能完整，且H2B核定位信号能够有效引导蛋白进入细胞核。

3. 火木层孔菌的DNase活性

在研究过程中，研究人员意外发现火木层孔菌的粗细胞裂解液能够在10分钟内完全降解1微克的线性PCR产物，其培养上清也显示出较弱的DNase活性。相比之下，模式菌株黑曲霉（Aspergillus niger）的相同处理几乎无此活性。进一步的抑制实验表明，EDTA可以部分抑制这种DNase活性，而额外添加Mg²⁺会逆转这种抑制，提示该DNase是一种依赖二价阳离子（尤其是Mg²⁺）的核酸酶。Zn²⁺则能通过直接取代催化位点的金属离子来抑制该活性。

四、讨论与结论

讨论部分总结：本研究的成功之处在于首次为火木层孔菌建立了遗传转化体系，并验证了* natR /诺尔丝菌素筛选系统、火木层孔菌 tef1 启动子和裂褶菌H2B启动子的功能性。eGFP和mCherry的成功表达为未来的亚细胞定位和蛋白功能研究提供了关键工具。然而，研究也指出了若干挑战：首先，针对 ku70 *位点的靶向敲除未能成功，表明实现精确的基因编辑仍需进一步优化；其次，Southern印迹显示的外源DNA多拷贝随机整合现象是限制非模式真菌遗传工程应用的常见问题，可能影响基因表达水平和基因组稳定性；最后，火木层孔菌强大的DNase活性被认为是降低转化效率和阻碍靶向整合的一个潜在重要障碍。

研究结论翻译：研究人员提供了确凿的证据，证明利用本研究开发的方法和工具可以对火木层孔菌进行遗传转化。这套工具包将允许对目标基因进行过表达以用于功能分析。然而，在进行此类实验并解读结果时，必须仔细考虑脱靶的多拷贝整合事件。鉴于eGFP和mCherry在火木层孔菌中具有功能性，研究人员认为这些报告基因是未来亚细胞定位研究中高度优先的工具。研究人员还发现了DNase活性是遗传工程面临的一个潜在挑战，并推测这可能限制了包括基因缺失或破坏在内的靶向方法。研究团队未来的工作将进一步推动这种重要产材真菌的遗传工程发展。