韩国空肠弯曲菌（C. jejuni）分离株基因组尺度代谢模型分析揭示克隆复合体（CC）水平谱系代谢结构及CC-443/CC-658表型分化

《Genomics & Informatics》：Genome-scale metabolic model analysis of Korean Campylobacter jejuni isolates reveals lineage-level metabolic structure

　　

空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni, C. jejuni）的基因组尺度代谢模型（genome-scale metabolic models, GSMMs）此前主要针对参考菌株开展研究，其在谱系水平上的特征仍知之甚少。研究人员利用gapseq为在韩国采集的86株C. jejuni分离株重建了GSMMs，并将其与同一批分离株上测得的7种底物体外利用数据进行联合分析。菌株特异性GSMMs按克隆复合体（clonal complex, CC）聚类：在具有≥2株分离株的全部9个CC中，CC内平均Jaccard距离均小于CC间平均距离；在所有菌株对中，CC内距离中位数为0.082，CC间为0.130（P < 0.001）。在体外表型中，9个CC中仅5个显示CC内距离小于CC间距离，且GSMM距离与体外距离仅弱相关（Mantel r = 0.13，P = 0.03）。在对两个特征对比鲜明的谱系进行的探索性比较中，CC-443（n = 7）对全部7种底物均显示负的平均z分数，而CC-658（n = 4）对全部7种底物均显示正的平均z分数，其中最高为亚硫酸盐（z = +0.95）。在GSMMs中，CC-443缺乏单胺/多胺氧化酶家族（monoamine/polyamine oxidase family）及泛酸/辅酶A（CoA）生物合成（pantothenate/CoA biosynthesis）相关反应，而CC-658富集于脂肪酸/磷脂生物合成（fatty acid/phospholipid biosynthesis）、唾液酸代谢（sialic acid metabolism）和厌氧硫呼吸（anaerobic sulfur respiration）。厌氧硫呼吸相关反应在CC-658中更常见（75%），高于其他CC（11%），这与其体外高亚硫酸盐利用相一致；当比较仅限于鸡分离株时，该差异仍然存在（CC-443为0% vs CC-658为100%）。在两种模拟肠道饮食（西方饮食和高纤维饮食）下的计算机模拟（in silico）生长模拟显示，在两种条件下CC-443的预测生长均持续低于CC-658（精确置换检验（exact permutation test），P = 0.048），尽管11个模型在每种饮食下仅产生4个不同预测值，限制了该比较的强度。这些结果表明，C. jejuni的代谢建模应考虑谱系水平多样性，而非依赖单一参考菌株GSMM。

空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni, C. jejuni）是细菌性食源性胃肠炎的重要病原之一，既往研究多关注其污染流行，而基因组尺度代谢模型（genome-scale metabolic models, GSMMs）研究主要集中于参考菌株，临床与食品分离株在谱系水平上的代谢多样性仍不清楚。C. jejuni碳水化合物分解代谢能力有限，主要依赖氨基酸和肽作为碳源与能源，并可利用甲酸、氢、亚硫酸盐和葡萄糖酸盐等作为电子供体，且这些底物利用能力存在菌株差异，进而影响宿主环境定植。因此，研究人员针对86株韩国C. jejuni分离株重建GSMMs，并与同批菌株的7种底物体外利用表型整合，旨在回答自动重建的GSMMs能否捕获由克隆复合体（clonal complex, CC）定义的谱系特异性代谢特征，以及体外表型变异在多大程度上反映于GSMM反应内容；同时探索CC-443与CC-658表型差异相关的模型特征，并用肠道模拟饮食条件下的计算机模拟生长验证。研究结论表明，CC可作为塑造GSMM反应组成的因素，代谢建模应纳入谱系水平多样性，而非依赖单一参考菌株。

关键方法如下：研究纳入2015—2023年韩国7个地区采集的86株C. jejuni，其中生鸡肉来源70株（81%）、人粪便来源16株（19%）。采用全基因组测序、组装与注释，并进行多位点序列分型（multilocus sequence typing, MLST）及CC归属；测定乳酸、甲酸、亚硫酸盐、葡萄糖酸盐、丝氨酸、脯氨酸和天冬酰胺7种底物的体外利用表型；以gapseq v1.2重建GSMMs；利用Jaccard距离、置换检验、Mantel检验和Fisher精确检验分析谱系结构及反应差异；在西方饮食和高纤维饮食两类肠道模拟条件下进行通量平衡分析（flux balance analysis, FBA）生长模拟。

结果部分：3.1 分离株信息及其谱系分布。86株分离株属于17个CC，其中9个CC具有≥2株，另8个为单例；最常见为CC-21（n = 36），其后为CC-354（n = 8）、CC-443（n = 7）、CC-464（n = 6）、CC-45（n = 6）、CC-607（n = 5）、CC-658（n = 4）、CC-5229（n = 3）和CC-48（n = 3）；鸡来源占81%，人来源占19%。该结果说明研究队列具有多个CC谱系且以鸡来源为主。

3.2 GSMM的谱系特异性聚类。研究人员为86株分离株重建GSMMs，平均每个模型含1505个反应（范围1391—1569），泛反应组含2313个独特反应。基于3655个菌株对的Jaccard距离分析显示，CC内距离中位数0.082小于CC间0.130，低36.9%；PERMANOVA伪F = 7.84，P < 0.001，Mantel r = 0.54；在9个具有≥2株的CC中，CC内平均距离均小于CC间平均距离，主成分分析（principal component analysis, PCA）亦显示按CC聚类，分离株水平bootstrap的95%置信区间不重叠。控制基因组与模型质量指标后，反应内容距离与CC归属的关联由r = 0.54降至r = 0.45，但仍显著（偏Mantel P = 0.001）；排除污染 isolate 后结果一致。该结果说明自动重建GSMMs可捕获CC水平结构。

3.3 GSMM与体外表型仅弱相关。体外表型以7种底物z分数向量的欧氏距离表示，CC内距离中位数2.50小于CC间3.09，但PERMANOVA不显著（伪F = 1.00，P = 0.42）；9个CC中仅5个CC内距离小于CC间距离。GSMM距离与体外表型距离仅弱相关（Mantel r = 0.13，P = 0.03）。CC-443在所有底物上呈负z分数，CC-658在所有底物上呈正z分数，其中亚硫酸盐z = +0.95、甲酸z = +0.84、葡萄糖酸盐z = +0.73；但体外表型距离的bootstrap置信区间在9个CC中均重叠。该结果说明谱系信号在GSMM中较体外表型更清晰，二者对应有限。

3.4 与CC-443和CC-658表型差异相关的GSMM反应差异。该比较为探索性。CC-443缺乏单胺/多胺氧化酶家族、泛酸/CoA生物合成等反应，名义P < 0.01的42个反应中16个经错误发现率（false discovery rate, FDR）校正后仍显著；CC-658富集脂肪酸/磷脂生物合成、厌氧硫呼吸等反应，15个中4个经FDR校正后显著。两谱系直接比较中厌氧硫呼吸反应名义显著（Fisher P = 0.024），但FDR校正后无反应显著。除CC-48外，其余CC均有FDR校正后差异反应，且受影响通路因谱系而异。CC-658由3株2023年鸡分离株和1株2020年人分离株组成，3株鸡分离株反应内容相同，人分离株与其相差229个反应；CC-443均为鸡分离株。仅比较鸡分离株时，厌氧硫呼吸反应在CC-658为100%、CC-443为0%（Fisher P = 0.008），但采集年份与谱系混杂。生长模拟显示，西方饮食下CC-443平均μ为0.351 ± 0.010、CC-658为0.371 ± 0.000（精确P = 0.048）；高纤维饮食下分别为0.302 ± 0.012和0.323 ± 0.000（精确P = 0.048）。但11个模型在每种饮食下仅4个不同预测值，效应量估计不可靠（9.4% bootstrap重采样合并标准差低于1e^?12），仅鸡分离株比较不显著（P = 0.142）。该结果说明反应差异与表型方向一致，但统计强度有限。

讨论部分总结：GSMMs可整合基因组信息与生化反应开展代谢表型模拟。本研究显示CC水平结构在GSMMs中清晰，而体外底物利用表型聚类较弱，二者仅弱相关；底物利用还受转录调控、蛋白表达和试验条件影响，反应内容本身不能完全捕获这些因素。CC-658的厌氧硫呼吸反应与其高亚硫酸盐z分数一致；CC-443缺乏泛酸/CoA生物合成和单胺/多胺氧化酶家族与其普遍低z分数一致，其中泛酸/CoA通路与三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环相关，且panBCD维生素B5生物合成位点变异曾与该物种宿主相关分化相联系，但本研究未实验验证维生素B5依赖性。局限包括：分离株来自单一国家且以鸡为主；7种底物未包含黏蛋白来源糖；自动重建依赖注释数据库；部分谱系样本量小；部分谱系富集反应未通过FDR校正；CC-658三株鸡分离株反应内容和预测生长相同，有效独立观测数小于名义样本量；采集年份与谱系混杂；CC-443与CC-658比较为探索性、属假设生成。

结论部分翻译：研究人员为86株韩国C. jejuni分离株重建GSMMs，发现谱系聚类，在全部9个CC中CC内距离均小于CC间距离，表明CC可能是塑造GSMM反应组成的因素。该聚类在体外表型中较弱，且GSMM与体外距离仅弱相关。然而，两个谱系提供了潜在基因型—表型联系：CC-443显示普遍较低的z分数并缺乏包括泛酸/CoA生物合成在内的若干反应，而CC-658富集厌氧硫呼吸，其反应与其亚硫酸盐高z分数+0.95相匹配。计算机模拟生长显示，这些反应差异伴随CC-443持续较低的预测生长，但各谱系内模型近乎相同限制了该比较的强度。这些发现表明，C. jejuni的基因组尺度代谢建模应考虑谱系水平多样性，而非依赖单一参考菌株。