《Journal of Cotton Research》：A visual system for evaluating CRISPR editing efficiency in cotton
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摘要专业翻译
背景：成簇规律间隔短回文重复序列及其关联蛋白（CRISPR/Cas）技术发展迅速；然而，目前基于原生质体的基因组编辑效率评估方法依赖昂贵仪器，且与某些实验策略不兼容，凸显了开发简便、经济高效替代方法的迫切需求。
结果：本研究利用花青素生物合成关键
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背景：成簇规律间隔短回文重复序列及其关联蛋白（CRISPR/Cas）技术发展迅速；然而，目前基于原生质体的基因组编辑效率评估方法依赖昂贵仪器，且与某些实验策略不兼容，凸显了开发简便、经济高效替代方法的迫切需求。
结果：本研究利用花青素生物合成关键基因GhF3H（黄烷酮3β-羟化酶）建立了棉花基因组编辑效率可视化评估系统，该基因的敲除可导致组织颜色发生明显变化。通过杂交和连续回交获得了红色背景棉花品系RZM24。研究人员构建了携带Cas9、Cas12a或CasΦ及其相应单链引导RNA（sgRNA）的表达载体，靶向GhF3H基因，并通过农杆菌介导转化导入下胚轴，随后进行愈伤组织诱导。成功编辑的愈伤组织呈现白色或白红嵌合表型，而未编辑愈伤组织保持红色。Cas9的编辑效率最高，其次为Cas12a，CasΦ的编辑效率最低。基因分型证实，白色和嵌合愈伤组织能够再生携带可遗传突变植株，且三种Cas系统诱导了不同类型的突变。
结论：该系统可在45天内实现编辑事件的快速可视化筛选，有助于CRISPR工具包的比较、新型核酸酶的验证以及sgRNA递送策略的优化。该方法有望推广至其他作物，为推进植物基因组工程提供实用解决方案。
论文解读
一、研究背景与科学问题
成簇规律间隔短回文重复序列及其关联蛋白（CRISPR/Cas）技术近年来发展迅猛，已衍生出多种高效基因组编辑系统。目前，植物基因组编辑效率的主流评估方法基于原生质体体系，通过测量绿色荧光蛋白（GFP）阳性原生质体占总原生质体的比例来判断编辑效率，被视为评估和优化CRISPR工具包的金标准。然而，该方法高度依赖流式细胞仪和荧光显微镜等昂贵专用设备，限制了其广泛应用。此外，原生质体体系还存在固有的技术局限：例如，无法用于测试驱动Cas9表达的组织特异性启动子以提高编辑效率，也无法兼容基于病毒诱导基因沉默（VIGS）递送FT基因-单链引导RNA（sgRNA）融合体以获得基因编辑后代等策略。因此，亟需建立一种简单、经济、快速的方法来监测新型核酸酶、sgRNA递送系统等在植物基因组工程中的编辑效率。
花青素色素沉着是理想的视觉标记，可通过肉眼直接观察。黄烷酮3β-羟化酶（F3H）是类黄酮生物合成途径中的关键酶，催化黄烷酮羟基化生成二氢黄酮醇，是黄酮醇和花青素合成的共同前体。沉默或敲除F3H会破坏色素形成，导致多种植物组织产生明显颜色变化。已有研究表明，在矮牵牛中抑制F3H可产生白花，在胡萝卜中沉默F3H可使紫色愈伤组织变白。基于花青素的可视化报告系统已在多种植物中成功用于快速评估基因组编辑效率。然而，棉花中尚未建立基于内源色素基因的可视化编辑效率评估体系。
二、研究内容与主要结论
本研究以花青素合成关键基因GhF3H为靶标，建立了棉花基因组编辑效率的可视化评估系统。研究人员通过杂交和连续五次回交，将表现红色愈伤组织的棉花突变体材料导入栽培品种ZM24的遗传背景，获得红色植株品系RZM24。VIGS实验证实，当GhF3H表达被敲低时，RZM24植株叶片从紫红色变为绿色，表明GhF3H的编辑事件可在愈伤组织形成早期（组织培养启动后45天内）通过肉眼直接识别。
研究人员分别构建了携带Cas9、Cas12a或CasΦ及其对应sgRNA的表达载体，靶向GhF3H基因（Gh_D11G1775），通过农杆菌介导转化棉花下胚轴并进行愈伤组织诱导培养。结果显示：Cas9、Cas12a和CasΦ转化产生的白色愈伤组织频率分别约为8.0%、5.3%和1.9%，嵌合愈伤组织频率分别约为7.0%、4.4%和2.3%。PCR分析确认100%的白色愈伤组织、60%的嵌合愈伤组织和7%的红色愈伤组织含有相应的Cas转基因。基因分型表明，白色和嵌合愈伤组织能够再生携带可遗传突变的植株，而红色愈伤组织再生的植株未被编辑。桑格测序色谱图显示白色愈伤组织出现重叠峰，高通量突变追踪（Hi-TOM）平台分析揭示了单个愈伤组织内存在混合突变类型。三种Cas系统诱导的突变类型存在差异：Cas9主要诱导1–5 bp缺失，而Cas12a和CasΦ主要诱导5–10 bp缺失。
三、关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：1）通过杂交和连续回交构建红色背景棉花品系RZM24；2）利用烟草脆裂病毒（TRV）载体进行病毒诱导基因沉默（VIGS）验证GhF3H功能；3）利用CRISPR RGEN在线平台设计sgRNA靶点序列；4）农杆菌介导的棉花下胚愈伤组织转化体系；5）基于CTAB法的基因组DNA提取及桑格测序进行突变鉴定；6）利用Hi-TOM高通量平台进行突变类型和编辑效率分析。
四、研究结果
GhF3H沉默导致RZM24叶片颜色由紫红色变为绿色：通过VIGS实验证实，GhF3H表达被敲低后，RZM24植株叶片颜色发生明显变化，表明GhF3H可作为可视化编辑报告基因。
三种Cas系统编辑效率存在显著差异：Cas9、Cas12a和CasΦ转化产生的白色愈伤组织频率分别为8.0%、5.3%和1.9%，嵌合愈伤组织频率分别为7.0%、4.4%和2.3%，表明Cas9编辑效率最高，Cas12a次之，CasΦ最低。
白色和嵌合愈伤组织与编辑事件高度相关：PCR分析显示100%的白色愈伤组织、60%的嵌合愈伤组织和仅7%的红色愈伤组织含有Cas转基因，表明白色和嵌合表型可作为编辑事件的可靠视觉指标。
编辑事件可遗传且突变类型因Cas系统而异：白色和嵌合愈伤组织成功再生出携带可遗传突变的植株，红色愈伤组织再生的植株未被编辑。Cas9主要诱导1–5 bp缺失，Cas12a和CasΦ主要诱导5–10 bp缺失，且单个愈伤组织内存在混合突变类型。
五、讨论与结论
该可视化系统具有以下优势：与原生质体方法相比，愈伤组织介导的编辑允许后续植株再生，可评估稳定突变及其遗传性；成本低廉，无需昂贵仪器；可在45天内快速完成编辑事件筛选。该系统可用于比较不同CRISPR变体的编辑效率、验证新型核酸酶以及优化sgRNA递送策略。该策略有望推广至其他作物物种。然而，该系统也存在局限性：由于视觉读数依赖于内源GhF3H的破坏，因此需要花青素色素沉着的植物品系，无法直接应用于典型的绿色或淡色基因型。未来可通过引入替代代谢或色素标记来扩大兼容性，同时需进一步评估三种Cas效应物的潜在脱靶切割事件。
研究结论：本研究建立了依赖GhF3H的可视化筛选系统，用于评估棉花稳定转化过程中的CRISPR/Cas编辑效率。编辑愈伤组织事件可通过花青素相关颜色表型轻松识别，避免了昂贵的早期分子筛选。研究人员成功比较了Cas9、Cas12a和CasΦ的相对编辑活性，证明了该可视化报告系统在核酸酶筛选中的实用价值。尽管该方法主要适用于靶基因破坏后产生可见色素表型的情况，但这种经济有效的策略为简化多种作物物种的基因组编辑工作流程提供了可行框架。
