白菜（Brassica rapa）雄核发育过程中的转录与表观遗传重编程机制研究

《Molecular Horticulture》：Transcriptional and epigenetic reprogramming during androgenesis in Brassica Rapa

摘要专业翻译 雄核发育涉及三个关键阶段：细胞重编程、全能性获得和胚胎发生起始（Ahmadi等，2018）。在体外胁迫条件下，晚期单细胞小孢子可偏离配子体发育途径转向胚胎发生，再生出单倍体或双单倍体植株（Perez-Perez等，2019）。尽管具有重要的生物技术价值，小孢子培养仍面临显著限制，包括诱导率低和难以建立稳定的诱导体系（Shumilina等，2015）。其中，基因型是最具挑战性的限制因素，即使在同一种内也直接制约诱导效率（Gao等，2024）。值得注意的是，只有花粉有丝分裂I之前的晚期单细胞小孢子具有热胁迫诱导能力（Zaki和Dickinson，1990）。 调控细胞重编程和胚胎发生的调控网络仍知之甚少，这归因于对特定调控位点及生殖细胞命运转变的分子机制研究有限（Corral-Martinez等，2020）。目前已鉴定出若干能够将体细胞重编程为胚性全能细胞的植物转录因子。例如，来自欧洲油菜（Brassica napus）的BABY BOOM（BBM）在小孢子中特异性表达时，可直接诱导细胞命运转变并触发体内雄核发育，无需胁迫处理（Boutilier等，2002）。BBM与LEC1和LEC2可协同诱导体细胞胚胎发生；后两者与L1L、ABI3和FUS3共同构成LAFL调控网络（Jia等，2014）。尽管ABI3和FUS3的过表达不能直接启动体细胞胚胎发生，但可赋予幼苗胚胎特征（Gazzarrini等，2004）。然而，BBM与LAFL因子是否在同一通路中发挥作用仍不清楚。 表观遗传修饰——特别是DNA甲基化和组蛋白修饰——在调控细胞分化和小孢子发育中也发挥重要作用（Zhao等，2022）。小孢子胚胎发生需要全基因组DNA去甲基化、组蛋白超乙酰化以及特定的组蛋白甲基化修饰，这些修饰共同松弛染色质结构，使转录因子能够结合并激活基因（El-Tantawy等，2014）。然而，目前研究仍主要局限于全基因组水平的分析，对特定基因组位点和靶向基因调控的探究十分有限。鉴于表观遗传修饰通常通过影响少量关键靶基因来协调发育进程，对这些修饰进行精细定位并鉴定关键调控因子，对于理解细胞命运转变机制至关重要（Yun等，2012）。 在本研究中，研究人员探究了白菜小孢子胚胎发生过程中的转录和表观遗传重编程，旨在阐明细胞命运转变和诱导效率的分子机制。研究结果预期将为提高单倍体育种效率和创制新种质奠定基础。 为探究雄核发育调控及小孢子胚胎发生过程中的表观遗传动态，研究人员对可诱导品系K2和不可诱导品系49CX进行了RNA-seq分析，覆盖晚期单细胞小孢子（lmsp）、热胁迫处理小孢子（hmsp）、对照小孢子（未经热胁迫的模拟处理，cmsp）以及2细胞、4细胞和8细胞胚胎阶段，并在两个品系中对多个发育阶段进行了WGBS和H3K4me3 ChIP-seq分析（图1A-B，图S1）。主成分分析（PCA）清晰地将小孢子的转录组谱与叶片组织区分开来。值得注意的是，热胁迫处理触发了K2小孢子中大规模的转录组重编程，使其转录组谱向早期胚胎状态靠近并逐步趋近。相比之下，49CX中对照小孢子（cmsp）与热胁迫处理小孢子（hmsp）之间未表现出转录组差异（图1C-D，图S2）。差异表达分析鉴定出K2中3371个热响应基因（1623个上调，1748个下调），下调基因富集于花粉发育和花粉管生长功能，而上调基因包含众多发育调控因子。值得注意的是，1523个基因在K2中被热胁迫特异性激活，与对照或49CX样本的重叠极少（图1E）。K-means聚类揭示了不同的时间表达模式：簇1（n=531）表现为短暂的胁迫响应性上调，无持续的胚性表达；而簇2-5（n=992）在胚胎发生过程中表现出持续或逐渐增强的表达（图1F）。GO分析表明，簇1富集于胁迫响应功能，包括HSP70-1和HSP81-2，而簇2-5显著富集于生物调控功能（n=215，p<0.005），包含关键胚性调控因子BBM、LEC1和LEC2（图S3）。对这215个基因的调控网络分析鉴定出热胁迫激活的四个相互关联的功能模块：植物激素生物合成与信号转导、胁迫响应、胚胎发生调控因子和表观遗传重塑因子，这些模块通过BAK1、PYR1和ABI3等枢纽基因相互连接，并进一步激活下游WRKY转录因子（图1G）。 全基因组甲基化模式保持一致，着丝粒区域呈高水平而染色体臂区域呈低水平。值得注意的是，WGBS分析揭示热诱导仅在可诱导品系K2中触发显著的CG甲基化降低，特别是在着丝粒和转座子（TE）区域，而不可诱导品系49CX小孢子中未出现此类降低。CHG和CHH甲基化保持低水平且无变化（图1H，图S4C）。K2 hmsp与lmsp之间的差异甲基化区域（DMR）分析鉴定出9726个高甲基化DMR和12478个低甲基化DMR，其中低甲基化DMR优先定位于基因相关区域（图1I）。有趣的是，尽管49CX中未检测到全基因组甲基化变化，但在基因体区域检测到数量相当的DMR，其中10.8%的高甲基化DMR和12.9%的低甲基化DMR与K2重叠（图S4A-B）。相关性分析显示，DMR与差异表达基因（DEG）在200 bp侧翼区域内的重叠极少：仅36个（2.4%）上调基因与高甲基化DMR共定位，55个（3.6%）与低甲基化DMR共定位（图1J）。然而，全基因组甲基化分析揭示可诱导小孢子中基因体甲基化显著降低，热胁迫导致进一步减少，而这种模式在不可诱导小孢子中不存在。值得注意的是，上调和下调基因均表现出低于平均水平的基因体甲基化（图1K）。此外，研究人员发现K2叶片组织中RNA指导的DNA甲基化（RdDM）通路基因表达水平低于49CX，尽管小孢子表达谱未显示显著的品种间差异（图S4D）。研究人员提出，固有的低基因体甲基化赋予转录可塑性，使基因能够在胁迫下灵活调控表达。 与未处理对照（cmsp）相比，K2热胁迫处理小孢子（hmsp）的全基因组H3K4me3水平变化极小，但发生了显著的重新分布，鉴定出12137个差异峰区域——大多数位于转录起始位点上游1 kb以内（图S5A-B）。其中，384个峰显著上调（log2（倍数变化）>2，P<0.05），124个峰下调，与对照处理仅显示37个上调和36个下调峰形成鲜明对比。携带H3K4me3标记的基因包括多个参与胚胎发育和细胞命运决定的转录因子，如WRKY25和WRKY61（图S5C）。研究人员进一步检验了小孢子培养过程中H3K4me3变化与基因表达之间的相关性。在1523个上调基因中，287个（18.8%）与热诱导的H3K4me3靶标重叠，而1182个下调基因中有146个（12.4%）与热降低的H3K4me3靶标重叠（图1J）。GO富集分析显示，这287个基因富集于“生物过程调控”和“代谢过程”（图S7）。此外，这些基因的基础H3K4me3水平高于其他DEG或随机对照，且H3K4me3变化与表达方向相关（图1L-M）。表达趋势图显示，287个靶向上调基因呈现两种模式：196个基因表现为热响应快速激活后迅速衰减，91个基因表现为逐渐上调并在2细胞或4细胞胚胎阶段达到峰值（图1M）。尽管BBM和LEC1等经典调控因子缺乏热诱导的H3K4me3变化，但bHLH49、NAC087、WRKY25和WRKY61等其他快速响应调控因子表现出强烈的H3K4me3-转录相关性（图S6）。因此，H3K4me3特异性地靶向并调控小孢子诱导过程中参与转录重编程的发育基因网络，既为快速响应基因提供即时激活信号，也为后续胚胎阶段的持续表达提供维持机制。 综上所述，这些结果表明热诱导触发涉及DNA甲基化变化和H3K4me3重新分布的协调性表观遗传重编程，低甲基化使胚胎相关基因能够灵活调整表达，而H3K4me3标记关键转录因子和发育基因，从而驱动小孢子从配子体发育向胚胎发生的细胞命运转变。 小孢子胚胎发生过程中细胞命运转变的转录和表观遗传机制仍有待阐明。在分子水平上，研究人员对白菜属物种的RNA-seq分析揭示了热胁迫后的快速转录组激活，包括关键胚性调控因子（BBM、LEC1、LEC2）、激素信号通路和表观遗传重塑机制的同步启动，提供了更精确和动态的表达谱。一个关键未解问题是这种转录激活是晚期小孢子的普遍特征还是仅限于特定亚群，这需要单细胞测序技术来区分。此外，胚性调控因子的机制作用仍存在争议，需要进行跨物种比较研究以阐明植物胚性调控网络的保守性和差异性，最终实现通过调控转录可及性来提高诱导效率。在表观遗传水平上，与白菜和大麦的研究一致，研究人员观察到热胁迫触发全基因组低甲基化，差异表达基因表现出显著较低的基因体甲基化，支持转录可塑性和位点特异性表观遗传修饰共同调控细胞命运转变的模型。组蛋白修饰也深刻影响胚胎发生效率（Li等，2014；Rymen等，2019），研究数据进一步确立了H3K4me3在雄核发育中作为活跃调控因子的作用。然而，H3K4me3与其他组蛋白修饰（特别是H3K27me3）之间的相互作用及其与额外表观遗传调控层的整合仍有待完全阐明。未来研究应聚焦于这些调控层如何协同驱动小孢子胚胎发生过程中的转录重编程。

论文解读

一、研究背景与科学问题

雄核发育（androgenesis）是植物单倍体育种的重要技术途径，涉及细胞重编程、全能性获得和胚胎发生起始三个关键阶段。在体外胁迫条件下，晚期单细胞小孢子可被诱导偏离正常的配子体发育途径，转向胚胎发生，最终再生为单倍体或双单倍体植株。尽管该技术具有重要的生物技术价值，小孢子培养仍面临诱导率低、诱导体系难以建立等显著限制，其中基因型是制约诱导效率的最关键因素——即使在同一物种内，不同品种的诱导能力也存在巨大差异。

目前，调控细胞重编程和胚胎发生的分子调控网络仍知之甚少。已有研究表明，部分植物转录因子如BABY BOOM（BBM）、LEC1和LEC2等能够将体细胞重编程为胚性全能细胞，其中BBM在小孢子中特异性表达时可直接诱导细胞命运转变并触发体内雄核发育，无需胁迫处理。BBM与LEC1、LEC2、L1L、ABI3和FUS3共同构成LAFL调控网络。然而，BBM与LAFL因子是否在同一通路中发挥作用仍不清楚。

表观遗传修饰——特别是DNA甲基化和组蛋白修饰——在调控细胞分化和小孢子发育中发挥重要作用。小孢子胚胎发生需要全基因组DNA去甲基化、组蛋白超乙酰化及特定组蛋白甲基化修饰，以松弛染色质结构，使转录因子能够结合并激活基因。然而，现有研究多局限于全基因组水平的整体分析，对特定基因组位点和靶向基因调控的探究十分有限。鉴于表观遗传修饰通常通过影响少量关键靶基因来协调发育进程，对这些修饰进行精细定位并鉴定关键调控因子，对于理解细胞命运转变机制至关重要。

基于上述背景，研究人员以白菜（Brassica rapa）为材料，系统探究了小孢子胚胎发生过程中的转录和表观遗传重编程机制，旨在阐明细胞命运转变的分子基础及诱导效率差异的根源，为提升单倍体育种效率提供理论依据。

二、研究内容与主要结论

研究人员以可诱导品系K2和不可诱导品系49CX为材料，对晚期单细胞小孢子（lmsp）、热胁迫处理小孢子（hmsp）、对照小孢子（cmsp）以及2细胞、4细胞和8细胞胚胎等多个发育阶段进行了系统分析。研究发现，热胁迫触发了K2小孢子的大规模转录组重编程，使其转录组谱向早期胚胎状态靠拢，而49CX则未出现明显转录组变化。差异表达分析鉴定出3371个热响应基因，其中1523个基因在K2中被热胁迫特异性激活。聚类分析将这些基因分为瞬时胁迫响应型和持续胚性表达型两类，后者显著富集于生物调控功能，包含BBM、LEC1和LEC2等关键胚性调控因子。调控网络分析进一步揭示了植物激素信号、胁迫响应、胚胎发生调控和表观遗传重塑四个功能模块的协同激活。

在全基因组甲基化层面，热诱导仅在可诱导品系K2中触发显著的CG甲基化降低，特别是在着丝粒和转座子区域，而49CX中未出现类似变化。差异甲基化区域（DMR）分析鉴定出大量低甲基化DMR优先定位于基因相关区域。值得注意的是，尽管DMR与差异表达基因的直接重叠有限，但可诱导小孢子表现出显著较低的基因体甲基化水平，且热胁迫导致进一步降低，提示固有的低基因体甲基化赋予转录可塑性。

在组蛋白修饰层面，热胁迫处理引起H3K4me3的显著重新分布，鉴定出12137个差异峰区域，其中384个峰显著上调、124个下调。携带H3K4me3标记的基因包括WRKY25和WRKY61等多个参与胚胎发育和细胞命运决定的转录因子。在1523个上调基因中，287个与热诱导的H3K4me3靶标重叠，这些基因表现出较高的基础H3K4me3水平，且H3K4me3变化与表达方向一致。表达趋势分析揭示了快速响应激活和渐进式上调两种不同的表达模式。

三、关键技术与方法

研究人员主要运用了以下核心技术手段：（1）RNA-seq转录组测序，对两个品系多个发育阶段进行全转录组表达谱分析；（2）全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS），用于全基因组DNA甲基化水平的精细图谱绘制；（3）染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq），针对H3K4me3组蛋白修饰进行全基因组定位分析；（4）主成分分析（PCA）、K-means聚类、GO富集分析和调控网络分析等生物信息学方法，用于多组学数据的整合解析。样本来源为白菜可诱导品系K2和不可诱导品系49CX，涵盖晚期单细胞小孢子、热胁迫处理小孢子、对照小孢子及多个早期胚胎发育阶段，并以叶片组织作为对照。

四、研究结果

1. 转录组重编程与热胁迫响应

PCA分析清晰区分了小孢子与叶片组织的转录组谱。热胁迫触发K2小孢子的大规模转录组重编程，使其向早期胚胎状态趋近，而49CX无此变化。K2中鉴定出3371个热响应基因，其中1523个为K2特异性热激活基因。K-means聚类区分了瞬时胁迫响应型和持续胚性表达型两类基因，后者富集生物调控功能并包含关键胚性调控因子。调控网络分析揭示了植物激素信号、胁迫响应、胚胎发生调控和表观遗传重塑四个功能模块的协同激活。

2. DNA甲基化动态与转录可塑性

WGBS分析显示，热诱导仅在K2中触发显著的CG甲基化降低，集中于着丝粒和转座子区域。DMR分析鉴定出9726个高甲基化DMR和12478个低甲基化DMR，低甲基化DMR优先定位于基因区域。尽管DMR与DEG的直接重叠有限，但可诱导小孢子表现出显著较低的基因体甲基化水平，且热胁迫导致进一步降低。研究人员提出固有的低基因体甲基化赋予转录可塑性，使基因能够在胁迫下灵活调控表达。

3. H3K4me3重分布与靶向基因调控

热胁迫引起H3K4me3的显著重新分布，鉴定出12137个差异峰区域。384个峰显著上调，124个下调。H3K4me3标记基因包括WRKY25和WRKY61等发育相关转录因子。287个上调基因与热诱导的H3K4me3靶标重叠，表现出较高的基础H3K4me3水平，且H3K4me3变化与表达方向一致。表达趋势分析揭示了快速响应激活和渐进式上调两种模式，表明H3K4me3既提供即时激活信号，也维持后期胚胎阶段的持续表达。

五、讨论与结论

研究结果表明，热诱导触发涉及DNA甲基化变化和H3K4me3重新分布的协调性表观遗传重编程：低基因体甲基化使胚胎相关基因能够灵活调整表达，而H3K4me3标记关键转录因子和发育基因，二者协同驱动小孢子从配子体发育向胚胎发生的细胞命运转变。

研究人员指出，RNA-seq分析揭示了热胁迫后快速转录组激活及关键胚性调控因子的同步启动。一个关键未解问题是这种转录激活是晚期小孢子的普遍特征还是仅限于特定亚群，这需要单细胞测序技术来区分。胚性调控因子的机制作用仍存在争议，需通过跨物种比较研究阐明植物胚性调控网络的保守性和差异性。在表观遗传层面，热胁迫触发全基因组低甲基化，差异表达基因表现出显著较低的基因体甲基化，支持转录可塑性和位点特异性表观遗传修饰共同调控细胞命运转变的模型。研究数据进一步确立了H3K4me3在雄核发育中作为活跃调控因子的作用，但H3K4me3与其他组蛋白修饰（特别是H3K27me3）之间的相互作用及其与额外表观遗传调控层的整合仍有待阐明。未来研究应聚焦于这些调控层如何协同驱动小孢子胚胎发生过程中的转录重编程，最终实现通过调控转录可及性来提高诱导效率，为单倍体育种技术优化和新种质创制提供理论基础。