《Journal of Molecular Histology》：Circ_0018814 promotes the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in ankylosing spondylitis by regulating the miR-944/KLF4 axis
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强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种主要累及脊柱和骶髂关节的慢性炎症性疾病。本研究探讨了circ_0018814通过调控miR-944/KLF4轴对AS中间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）
强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种主要累及脊柱和骶髂关节的慢性炎症性疾病。本研究探讨了circ_0018814通过调控miR-944/KLF4轴对AS中间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）成骨分化的影响，并评估其在AS进展中的潜在作用。研究人员利用GSE203155作为探索性筛选数据集，识别与AS-MSCs成骨分化相关的候选circRNA。进一步在骨髓样本和原代MSCs中评估circ_0018814的表达。采用蛋白质印迹法、碱性磷酸酶（ALP）检测和茜素红S染色评估circ_0018814对AS患者MSCs成骨分化标志物（ALP、RUNX2、COL1A1）的影响。通过荧光素酶报告基因和RNA免疫沉淀实验证实circ_0018814、KLF4和miR-944之间的靶向关系。采用荧光原位杂交进行细胞定位。在AS小鼠模型中进一步评估circ_0018814对AS病变和MSCs分化的影响。结果显示，过表达circ_0018814显著增强成骨标志物ALP、RUNX2和COL1A1的表达，并促进MSCs的成骨分化。此外，circ_0018814通过靶向miR-944调控KLF4表达。抑制miR-944可上调KLF4表达并促进成骨分化。在AS小鼠模型中，下调circ_0018814显著减轻脊柱病变，恢复miR-944和KLF4的正常表达水平，并减少疾病相关的成骨改变。本研究表明，circ_0018814通过调控miR-944/KLF4轴在AS的病理进展中发挥重要作用。circ_0018814可能作为AS的新型潜在治疗靶点，为未来的治疗策略提供新的见解。然而，由于尾静脉注射慢病毒载体并非MSCs特异性递送，体内研究结果应谨慎解读。
论文解读文章
一、研究背景与研究目的
强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种主要累及脊柱和骶髂关节的慢性进行性炎症性疾病，常导致进行性骨融合和脊柱僵硬。尽管现有治疗手段包括非甾体抗炎药（NSAIDs）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）抑制剂和白介素-17（IL-17）抑制剂等，能在一定程度上缓解症状并延缓疾病进展，但疗效有限且无法根治。尤其在AS晚期，许多患者仍面临严重的功能损害和生活质量下降。因此，深入探索AS的分子机制并开发新型治疗靶点具有重要意义。
近年来研究发现，AS患者的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）表现出增强的成骨分化潜能，这可能是导致AS病理性骨化（如韧带骨化和骨桥形成）的关键因素。环状RNA（circular RNAs，circRNAs）是一类具有独特环状结构的新型非编码RNA，其高稳定性和保守性使其在多种疾病（包括AS）的发病机制中发挥重要调控作用。本研究旨在探讨circ_0018814是否通过调控miR-944/KLF4轴影响AS-MSCs的成骨分化，从而揭示AS进展的新分子机制并提供潜在治疗靶点。
二、主要技术方法
研究人员从GEO数据库GSE203155数据集中筛选差异表达的circRNA，并通过circinteractome和circBank数据库预测circ_0018814的靶向miRNA，利用PITA、RNA22和microT数据库预测miR-944的靶基因。骨髓样本来自宁夏回族自治区人民医院接受全髋关节置换术的AS患者和股骨颈骨折患者（非AS对照组）。采用Ficoll密度梯度离心法分离人骨髓来源MSCs，并通过流式细胞术鉴定表面标志物（CD105、CD90、CD73阳性，CD45、CD14、CD34阴性）。采用慢病毒载体实现circ_0018814的敲低和过表达，利用脂质体转染试剂将miR-944模拟物/抑制剂及KLF4过表达/敲低质粒导入细胞。通过双荧光素酶报告基因实验和RNA免疫沉淀（RIP）验证靶向关系，采用荧光原位杂交（FISH）进行细胞定位。动物实验方面，采用蛋白聚糖诱导BALB/c小鼠建立AS模型，通过尾静脉注射慢病毒载体进行干预。
三、研究结果
1. Circ_0018814在AS-MSCs成骨分化过程中异常高表达
通过分析GSE203155数据集，研究人员发现circ_0018814是AS-MSCs成骨分化相关的候选circRNA。qRT-PCR结果显示，circ_0018814在AS患者骨髓样本中显著上调。在成骨诱导后，AS-MSCs中circ_0018814表达呈时间依赖性增加（第3天升高3倍，第7天升高5倍，第14天升高8倍），而非AS对照MSCs仅在第14天升高1.5倍。FISH进一步证实circ_0018814在AS-MSCs中表达更高，且定位于细胞核和细胞质。
2. Circ_0018814促进AS-MSCs的成骨分化
敲低circ_0018814显著降低成骨标志物（ALP、RUNX2、COL1A1）的蛋白表达、ALP活性和基质矿化程度，而过表达circ_0018814则产生相反效果，表明circ_0018814促进AS-MSCs的成骨分化。
3. Circ_0018814靶向miR-944调控AS-MSCs成骨分化
通过数据库交集分析，研究人员确定miR-944为circ_0018814的候选靶miRNA。双荧光素酶报告基因实验和RIP实验证实circ_0018814与miR-944存在直接结合。FISH显示两者共定位于细胞质。敲低circ_0018814显著上调miR-944表达，而过表达则抑制miR-944。功能实验表明，miR-944过表达抑制成骨分化，而抑制miR-944则促进成骨分化。
4. MiR-944靶向KLF4调控AS-MSCs成骨分化
通过数据库预测和双荧光素酶报告基因实验，研究人员证实miR-944直接靶向KLF4的3'UTR区域。miR-944过表达抑制KLF4表达，而抑制miR-944则上调KLF4。过表达circ_0018814上调KLF4，敲低则下调KLF4。KLF4过表达显著增强成骨标志物（ALP、RUNX2、COL1A1、OPN、SP7、BMP2）表达、ALP活性和基质矿化，而敲低KLF4则产生抑制作用。
5. Circ_0018814通过miR-944/KLF4轴促进AS-MSCs成骨分化
在敲低circ_0018814的基础上，同时抑制miR-944或过表达KLF4可逆转circ_0018814敲低导致的成骨抑制效应，包括恢复成骨标志物表达、ALP活性和基质矿化水平，证实circ_0018814通过miR-944/KLF4轴发挥作用。
6. Circ_0018814在体内通过增强MSCs成骨分化促进AS进展
在蛋白聚糖诱导的AS小鼠模型中，敲低circ_0018814显著减轻脊柱病变，改善脊柱活动度，恢复miR-944和KLF4的正常表达水平，并降低成骨标志物（ALP、RUNX2、COL1A1）的表达。
四、讨论与结论
讨论部分总结： 本研究表明circ_0018814在AS-MSCs成骨分化过程中上调，通过海绵吸附miR-944上调KLF4表达，从而促进成骨分化。这一发现揭示了circRNA/miRNA/KLF4轴在AS中的新调控机制。研究人员指出，KLF4在成骨分化中的作用存在争议，可能依赖于细胞类型、分化阶段和信号通路交叉对话等特定环境因素。本研究中KLF4在circ_0018814/miR-944轴背景下发挥促成骨作用，为理解其功能提供了新的具体情境。研究局限性包括：仅探讨了单一调控轴而未涉及其他潜在机制；样本量较小；未探究circ_0018814的临床意义；对照组为股骨颈骨折患者而非健康志愿者；未通过发散引物扩增、RNase R抗性检测等方法实验验证circ_0018814的环状结构；尾静脉注射慢病毒不具有MSCs特异性，不能排除对其他细胞群体的系统性影响；BALB/c小鼠模型的Th2极化微环境可能不完全代表人类AS患者更复杂的免疫景观。
结论部分翻译： 总之，本研究表明circ_0018814通过靶向miR-944调控KLF4表达，从而促进AS中MSCs的成骨分化。这一发现为AS的发病机制提供了潜在的分子基础，并为未来开发circRNA靶向治疗策略提供了理论支持。然而，由于递送策略并非MSCs特异性，体内机制解读应保持谨慎。
