桔梗菊粉型果聚糖PGP-1通过TLR4/NF-κB通路诱导巨噬细胞M1极化发挥免疫调节与间接抗肿瘤活性

《Natural Products and Bioprospecting》：Isolation, structural characterization, immunomodulatory and indirect tumoricidal activities of an inulin-type fructan from Platycodon grandiflorus via macrophage M1 polarization through the TLR4/NF-κB pathway

　　

本研究从桔梗（Platycodon grandiflorus）根中成功分离纯化出一种均一多糖，命名为PGP-1。通过甲基化分析、气相色谱-质谱联用（GC–MS）和核磁共振波谱（NMR）进行全面的结构表征，鉴定PGP-1为一种菊粉型果聚糖，其主链主要由→1)-β-D-Fruf-(2→构成，并含有末端β-D-Fruf-(2→和α-D-Glcp-(1→残基，这与先前报道的桔梗果聚糖的结构特征一致。与依赖广谱非特异性细胞毒性的传统化疗药物不同，生物学评价揭示PGP-1是一种安全且靶向的免疫调节剂。具体而言，PGP-1通过Toll样受体4/核因子-κB（TLR4/NF-κB）信号通路有效诱导RAW264.7细胞向M1型巨噬细胞极化，显著增强其吞噬能力，并促进一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）等杀瘤因子的强效释放。关键在于，研究人员利用模拟肿瘤微环境的巨噬细胞-肿瘤Transwell共培养模型证明，PGP-1对癌细胞几乎无直接细胞毒性，但通过增强巨噬细胞介导的免疫反应，对肝癌（H22）和肺癌（LLC）细胞发挥了强大的间接抗肿瘤活性。这些发现为该多糖的安全性与其抑瘤功效之间的关联提供了初步证据，表明PGP-1作为一种低毒性的天然免疫增强剂在癌症免疫治疗中具有潜力。

论文解读文章

一、研究背景与研究目的

肿瘤微环境（TME），尤其是其中的免疫细胞组成及其极化状态，对肿瘤进展和治疗反应起着至关重要的调控作用。尽管巨噬细胞作为TME中的关键免疫细胞是极具前景的治疗靶点，但当前癌症治疗的主要瓶颈在于传统策略引发的严重不良反应。与传统化疗药物对恶性细胞和正常体细胞均表现出直接、广谱的细胞毒性不同，天然来源的生物活性大分子，特别是植物多糖，提供了一种更安全且极具前景的新范式。它们作为精准的免疫调节剂而非直接的细胞毒素，能够以显著较低的毒性有效重塑免疫抑制性肿瘤微环境。

桔梗（Platycodon grandiflorus）作为一种兼具药用和食用价值的植物，其多糖已被证实具有免疫调节活性。然而，目前研究中一个尚未充分探索的关键科学问题是，如何将这类多糖的安全性特征与其强大的抗肿瘤活性进行机制上的整合。将这些大分子的抗肿瘤功效仅仅归因于直接细胞毒性，与其固有的安全性特征相矛盾。因此，阐明这些多糖是通过直接作用还是间接免疫动员来抑制肿瘤生长，对于深入理解其真实机制至关重要。本研究旨在从桔梗中分离纯化出一种均一多糖PGP-1，探究其结构特征，并重点阐明其通过诱导巨噬细胞M1极化发挥间接抗肿瘤活性的免疫调节机制，从而建立其安全性与抑瘤功效之间的逻辑联系。

二、主要技术方法

1. 1.
   提取与纯化：采用热水浸提法，并通过单因素试验和Box-Behnken响应面法优化提取参数（最佳条件：加热时间100分钟，温度75°C，液料比15 mL/g，提取2次）。粗多糖经Sevag法脱蛋白后，依次通过DEAE纤维素-52阴离子交换层析和Sephadex G-50凝胶过滤层析进行纯化，得到均一多糖组分PGP-1。
2. 2.
   结构表征：
   • •
     分子量与纯度：采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）测定分子量（Mw）为2.13 × 10³ Da。
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     化学组成：采用苯酚-硫酸法测糖含量，Bradford法测蛋白含量，高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法（HPAEC-PAD）分析单糖组成（果糖:葡萄糖 = 90.43:9.57）。
   • •
     光谱与色谱分析：利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析官能团；通过甲基化分析和气相色谱-质谱联用（GC–MS）鉴定糖苷键连接方式（主要连接键为→1)-Fruf-(2→）。
   • •
     核磁共振波谱（NMR）：综合运用¹H、¹³C、DEPT-135、COSY、HSQC、HMBC、ROESY和TOCSY等多种一维和二维NMR技术确定多糖的精细结构。
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     微观形貌：采用扫描电子显微镜（SEM）观察多糖的微观形态。
3. 3.
   生物活性评价：
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     细胞实验：以小鼠单核巨噬细胞RAW264.7、小鼠肝癌细胞H22和小鼠肺癌细胞LLC为模型。使用CCK-8法检测细胞活力；通过试剂盒检测NO、TNF-α和IL-6等免疫因子释放；采用中性红摄取实验评估巨噬细胞吞噬功能；利用流式细胞术和蛋白质印迹法（Western blot）检测M1/M2型巨噬细胞标志物（如CD86、iNOS、CD206、Arg-1）的表达。
   • •
     机制研究：使用特异性信号通路抑制剂（包括SP600125、NSC118218、BAY11-7082、TAK-242和NSC15139）预处理巨噬细胞，结合Western blot检测TLR4、p65、IκBα及其磷酸化水平的变化，以探究PGP-1激活巨噬细胞的信号通路。
   • •
     间接抗肿瘤活性验证：采用条件培养基（CM）实验和巨噬细胞-肿瘤细胞Transwell共培养模型，模拟TME，评估PGP-1激活的巨噬细胞对肿瘤细胞活力的间接抑制作用。
4. 4.
   内毒素排除验证：通过鲎试验（LAL）和多粘菌素B（PMB）中和实验，确认PGP-1的免疫调节活性源自其自身，而非内毒素污染。

三、研究结果

3.1 PGP-1的提取参数优化

通过响应面法优化，确定了桔梗粗多糖的最佳热水提取工艺为：加热时间100 min，加热温度75 °C，液料比15 mL/g，提取2次。在此条件下，平均提取率达到18.58%。该方法相较于以往报道，具有耗时更短（100 min vs. 180 min）和能耗更低（75 °C vs. 90 °C）的优势。

3.2 PGP-1的结构表征

HPGPC曲线显示PGP-1为单一对称峰，分子量为2.13 × 10³ Da，不含蛋白质和糖醛酸，总糖含量为92.80%。单糖组成为果糖和葡萄糖，摩尔比为90.43:9.57。FT-IR光谱显示其具有典型的多糖特征吸收峰，并在937、879和817 cm^-1处出现指示β-构型呋喃果糖的特征峰。甲基化和GC–MS分析鉴定出四种主要的部分甲基化糖醇乙酸酯（PMAA），对应末端-Fruf（t-Fruf）、→1)-Fruf-(2→（1,2-Fruf）、→1,6)-Fruf-(2→（1,2,6-Fruf）和末端-Glcp（t-Glcp），其中→1)-Fruf-(2→占比高达81.97%，证实其为菊粉型果聚糖。综合1D和2D NMR分析，最终确定PGP-1的结构为一条线性菊粉型果聚糖，主链由β-(2→1)连接的呋喃果糖残基构成，末端分别连接一个α-D-吡喃葡萄糖和一个β-D-呋喃果糖残基。SEM图像显示PGP-1呈现片状堆叠的均一宏观结构。

3.3 PGP-1诱导M1型巨噬细胞极化

• •
  PGP-1诱导巨噬细胞产生强烈的免疫应答：CCK-8实验表明，PGP-1（25–200 μg/mL）处理RAW264.7细胞48小时后，以浓度依赖性方式促进细胞增殖。同时，PGP-1显著诱导NO的产生，并提高TNF-α和IL-6的水平。中性红摄取实验结果显示，PGP-1增强了巨噬细胞的吞噬能力。LAL和PMB实验排除了内毒素污染的干扰，证实上述免疫活性是PGP-1本身的固有属性。
• •
  PGP-1选择性促进M1型巨噬细胞极化：实时定量PCR结果显示，PGP-1显著上调M1型标志物iNOS、IL-6和TNF-α的mRNA表达，而对M2型标志物Arg-1无显著影响。流式细胞术和Western blot分析进一步在蛋白水平证实，PGP-1选择性增强M1型表面标志物CD86和iNOS的表达，而不影响M2型标志物CD206和Arg-1的表达。

3.4 PGP-1通过促进巨噬细胞活化间接抑制肿瘤细胞活性

直接共孵育实验显示，即使在200 μg/mL的高浓度下，PGP-1本身对H22和LLC癌细胞的活力也无明显直接抑制作用。然而，当使用PGP-1刺激后的巨噬细胞条件培养基（CM）处理肿瘤细胞时，H22和LLC细胞的存活率分别被抑制了51.71%和53.77%（在200 μg/mL浓度下）。在Transwell共培养体系中，PGP-1（200 μg/mL）同样使与巨噬细胞共培养的肿瘤细胞活力降低约30%。此外，在共培养体系中，PGP-1处理组的M1型细胞因子（IL-6和TNF-α）水平虽低于单独刺激组，但仍显著高于未加PGP-1的共培养组，表明PGP-1能有效对抗肿瘤细胞诱导的M2型极化趋势，维持M1型免疫微环境。

3.5 PGP-1通过TLR4-NF-κB通路促进巨噬细胞活化

通过使用一系列特异性信号通路抑制剂预处理RAW264.7细胞，发现NF-κB抑制剂（BAY11-7082）和TLR4抑制剂（TAK-242）能最有效地抑制PGP-1诱导的NO分泌，使其降至接近基线水平。Western blot分析进一步证实，PGP-1处理显著上调了TLR4蛋白的表达，并增加了p-p65/p65和p-IκBα/IκBα的比值，表明NF-κB通路被激活。

四、讨论与结论

本研究成功从桔梗中分离纯化出一种分子量为2.13 kDa的均一菊粉型果聚糖PGP-1，并系统阐明了其结构。关于甲基化分析中检测到的微量→1,6)-β-D-Fruf-(2→（2.19%）与NMR数据之间的差异，研究人员将其归因于果聚糖甲基化分析中可能存在的技术局限性（如不完全甲基化），并强调所有分析手段均指向同一基本结构——一种以单个末端葡萄糖为特征的线型菊粉型果聚糖。

在药理活性方面，本研究的核心发现是：PGP-1的抗肿瘤功效主要通过重塑免疫微环境实现，而非直接细胞毒性。PGP-1对肿瘤细胞几乎无直接杀伤作用，这与其作为药食同源植物衍生物的安全性高度一致。然而，在模拟TME的共培养模型中，PGP-1能有效逆转肿瘤细胞诱导的免疫抑制，驱动巨噬细胞向抗肿瘤的M1表型极化，进而释放NO、TNF-α和IL-6等杀瘤因子，实现对肿瘤细胞的“间接杀伤”。这种靶向的免疫重编程策略，完美地将多糖的安全性与高效的抗肿瘤活性结合起来。

研究结论：本研究表明，从桔梗中分离的菊粉型果聚糖PGP-1是一种安全的免疫触发剂而非细胞毒剂。它通过TLR4/NF-κB信号通路诱导巨噬细胞向M1型极化，从而在体外共培养模型中发挥强大的间接抗肿瘤活性。这些发现为PGP-1作为一种高效、低毒的天然免疫增强剂用于癌症免疫治疗提供了科学依据。