内生真菌Aspergillus spelaeus GDGJ-286来源的抗氧化活性代谢产物及其神经保护作用研究

《Natural Products and Bioprospecting》：Antioxidant metabolites from the endophytic fungus Aspergillus spelaeus

　　

从内生真菌Aspergillus spelaeus GDGJ-286中分离得到5个未描述的化合物，包括2个drimane型倍半萜类化合物asperdrimanes A和B（1和2），以及3个酰胺类化合物asperspamides A–C（3–5），同时获得4个已知代谢产物6–9。通过综合分析核磁共振波谱（NMR）、液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）、Marfey法和X射线晶体学，成功确定了这些化合物的结构。Asperdrimanes A和B（1和2）为具有螺环-β-内酯结构特征的drimane型倍半萜类化合物。Asperspamide B（4）在ABTS、FRAP和DPPH测试中表现出优异的抗氧化能力，并在过氧化氢诱导的PC12细胞氧化损伤模型中显示出显著的神经保护作用，展现出强效的抗凋亡和抗坏死特性。这些发现凸显了asperspamide B作为开发抗氧化剂先导化合物的潜力。

论文解读：内生真菌Aspergillus spelaeus GDGJ-286中抗氧化活性代谢产物的发现与神经保护作用研究

一、研究背景与目的

氧化损伤是当体内氧化剂产生与抗氧化防御体系之间的平衡被打破时所发生的病理过程。这种失衡可由内源性代谢过程（如线粒体内氧化磷酸化效率低下，导致过量活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生并引发线粒体功能障碍）以及外源性因素（如环境毒素）共同触发。低水平的ROS在免疫功能、细胞信号转导和血管调节中发挥重要作用，然而一旦其浓度超过机体抗氧化能力，便会损伤脂质、蛋白质和核酸，导致代谢紊乱。中枢神经系统因其高脂质含量和高耗氧量，尤其容易遭受氧化损伤。氧化应激通过促进神经元组分的生化改变、加剧线粒体功能障碍和神经炎症，参与神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）的发生发展，最终导致细胞大分子损伤、坏死和凋亡性细胞死亡。因此，寻找有效的抗氧化剂对于神经退行性疾病的防治具有重要意义。

真菌作为一类多样性丰富且生态学上至关重要的生物类群，以产生多种具有多样生物活性的特殊代谢产物而闻名。其中，曲霉属（Aspergillus）真菌广泛分布于陆地和海洋生态系统，已成为发现新型生物活性特殊代谢产物的极具潜力的资源库，尤其在抗氧化活性方面表现突出。例如，从Aspergillus sp. F1-8A中分离的独特二苯醚杂合体asplactones A、B和D表现出强效的DPPH自由基清除活性；从Aspergillus ochraceus中分离的(+)-4,7-dihydroxymellein通过上调谷胱甘肽和清除ROS，剂量依赖性地减轻了H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤，展现出优异的抗氧化和神经保护功效。

研究人员所在课题组长期致力于从真菌中发掘新型生物活性天然产物。在前期研究中，内生真菌Aspergillus spelaeus GDGJ-286已被证实是结构多样的特殊代谢产物的丰富生产者，曾从中分离得到两个含硫杂二聚体sucurchalasins A和B（由一个细胞松弛素和一个大环内酯部分组成）以及一系列细胞松弛素单体和大环内酯衍生物。基于上述发现，研究人员对该菌株的代谢潜力进行了进一步深入研究，以期发现更多具有抗氧化和神经保护活性的新型天然产物。

二、主要技术方法

研究人员采用硅胶柱色谱、ODS柱色谱和高效液相色谱（HPLC）等多种色谱技术，对Aspergillus spelaeus GDGJ-286的乙酸乙酯提取物进行系统的分离纯化。化合物结构鉴定综合运用了核磁共振波谱（NMR）、高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESIMS）、液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）、Marfey法、电子圆二色谱（ECD）及X射线晶体学等多种分析手段。此外，通过ABTS、FRAP和DPPH自由基清除实验评价化合物的抗氧化活性，采用CCK-8法检测细胞毒性和神经保护活性，利用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平，并通过YO-PRO-1/PI双染色评估细胞凋亡和坏死情况。

三、研究结果

3.1 结构鉴定

通过HR-ESIMS、NMR及2D NMR综合分析，确定了5个新化合物的平面结构和相对构型。Asperdrimane A（1）分子式为C₂₆H₂₉NO₈，由一个drimane型倍半萜单元和一个N-乙酰酪氨酸残基通过酯键连接而成，是自然界中首个由drimane型倍半萜与N-乙酰酪氨酸组成的杂合天然产物。其绝对构型通过X射线衍射确定为1R,4R,5R,10S,2′S。Asperdrimane B（2）分子式为C₁₅H₁₈O₅，为不含氨基酸残基的drimane型倍半萜，其绝对构型通过ECD光谱和TDDFT计算确定为1R,4R,5R,10S。两个化合物均含有螺环-β-内酯结构单元。

Asperspamide A（3）分子式为C₂₄H₂₇N₃O₇，通过HMBC相关和HR-ESIMS/MS碎片分析确定了其残基序列为3-羟基邻氨基苯甲酸-脯氨酸-缬氨酸-对羟基苯甲酸。脯氨酸残基的Δδ_βγ值为4.0 ppm，支持其反式构型；Marfey法分析确认缬氨酸和脯氨酸均为L-构型。Asperspamide B（4）分子式为C₁₆H₁₄N₂O₆，含有两个1,2,4-三取代苯环、两个乙酰氨基和一个羧基，结构经X射线衍射进一步验证。Asperspamide C（5）分子式为C₁₇H₁₆N₂O₆，与4相比，5-OH被甲氧基取代。

3.2 抗氧化活性

ABTS、FRAP和DPPH实验结果显示，化合物4、7和9在100 μM浓度下表现出显著的ABTS自由基清除能力；在低于50 μM浓度时，其活性优于阳性对照Trolox，其中化合物4在所有测试浓度（12.5、25、50和100 μM）下均表现尤为突出。FRAP实验表明化合物4和7具有较强的抗氧化活性，且化合物4在任意浓度下的活性均优于Trolox。然而，在DPPH自由基清除实验中，所有化合物在100 μM浓度下的活性均弱于Trolox。

3.3 细胞毒性与体外神经保护活性

CCK-8实验结果显示，除化合物6外，化合物1–9在低于50 μM浓度下对PC12细胞未造成显著的活力损失。60 μM H₂O₂处理使PC12细胞活力降低约50%。化合物4、7和9在所有测试浓度（12.5、25和50 μM）下均显著提高细胞活力；化合物3和8在25和50 μM浓度下表现出保护作用；化合物1和5仅在50 μM浓度下恢复细胞活力，与Trolox效果相当；化合物2对H₂O₂损伤的PC12细胞无保护作用，而化合物6在25和50 μM浓度下加重了细胞损伤。

3.4 化合物4对细胞内ROS水平的抑制作用

DCFH-DA荧光探针染色结果表明，H₂O₂损伤后PC12细胞内ROS水平显著升高，出现明亮的绿色荧光。化合物4以浓度依赖性方式降低ROS水平，且在50 μM浓度下，其ROS清除活性优于阳性对照Trolox。

3.5 化合物4的抗凋亡和抗坏死活性

YO-PRO-1（标记凋亡细胞，绿色荧光）和PI（标记坏死细胞，红色荧光）双染色实验显示，H₂O₂处理后出现显著的荧光信号。当加入化合物4后，凋亡和坏死细胞数量以浓度依赖性方式显著减少。在50 μM浓度下，化合物4对PC12细胞的保护作用明显强于阳性对照Trolox。

四、结论与讨论

本研究从内生真菌Aspergillus spelaeus GDGJ-286中分离得到5个未描述的化合物（2个drimane型倍半萜和3个酰胺类化合物）及4个已知化合物。其中，asperdrimane A（1）是自然界中首个由drimane型倍半萜与N-乙酰酪氨酸组成的杂合天然产物。Asperspamide B（4）和WIN 66306（7）在ABTS、FRAP和DPPH测试中表现出优异的抗氧化能力。Asperspamide B（4）、WIN 66306（7）和nectriatide（9）能有效保护PC12细胞免受H₂O₂诱导的氧化损伤。特别是asperspamide B（4）展现出强效的抗凋亡和抗坏死能力，有望作为开发抗氧化剂的先导化合物。该研究为从真菌来源发现新型抗氧化和神经保护活性天然产物提供了重要参考，也为氧化应激相关神经退行性疾病的药物研发提供了新的候选分子。