《Molecular Biomedicine》：Non-thermal argon plasma therapy alleviates atopic dermatitis by reducing keratinocyte oxidative stress
编辑推荐：
特应性皮炎（AD）是一种常见的炎症性皮肤病，伴有相当大的疾病负担。尽管生物制剂已经问世，但有效治疗方面仍存在大量未满足的需求。本研究旨在评估非热氩等离子体（NAP）对轻中度AD患者的治疗效果。在AD治疗后评估湿疹面积严重度指数（EASI）、数字评定量表（NRS
特应性皮炎（AD）是一种常见的炎症性皮肤病，伴有相当大的疾病负担。尽管生物制剂已经问世，但有效治疗方面仍存在大量未满足的需求。本研究旨在评估非热氩等离子体（NAP）对轻中度AD患者的治疗效果。在AD治疗后评估湿疹面积严重度指数（EASI）、数字评定量表（NRS）和皮肤病生活质量指数（DLQI）。采用16S rRNA测序评估皮肤微生物组的变化。使用屋尘螨（HDM）诱导的AD小鼠模型评估NAP对AD样皮损、免疫细胞募集和细胞因子表达的影响。在NAP治疗后分析氧化应激参数及相关分子标志物。与假对照组相比，NAP治疗导致EASI、NRS和DLQI评分显著降低，反映AD症状的缓解和生活质量的改善。微生物组分析显示NAP治疗后微生物多样性发生显著改变。NAP改善了小鼠HDM诱导的AD，表现为表皮厚度、免疫细胞募集以及关键细胞因子（尤其是角质形成细胞中的白细胞介素（IL）-33）表达的降低。此外，NAP治疗下调了氧化应激标志物，与IL-33表达的降低相印证，并强调了氧化应激在AD病理中的作用。本研究提示非热等离子体在轻中度AD管理中的治疗潜力。需要进一步的广泛临床试验来验证这些发现并了解其长期效应和意义。试验注册：CRIS，KCT0008949，于2023年10月10日回顾性注册，网址为https://cris.nih.go.kr/cris/search/detailSearch.do?seq=25713。
特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种慢性、复发性炎症性皮肤病。近年来的系统分析估计AD的全球患病率为2.6%，约影响2.04亿人，包括1.03亿儿童和1.01亿成人。全球疾病负担研究2021报告显示，过去三十年间AD病例数持续增加，并预测到2050年将进一步上升。AD在全球非致死性疾病负担中也占有相当大的比例。生物制剂的出现为AD治疗带来了显著进展，靶向白细胞介素（interleukin，IL）-4的单克隆抗体可调节2型辅助性T细胞（T helper 2，Th2）反应，在AD中具有显著的临床疗效。随后，靶向IL-4以外细胞因子（如IL-13）的人源单克隆抗体也被开发并用于AD治疗评估。然而，生物制剂治疗存在若干局限性：部分患者仍有残留症状；部分患者在治疗期间出现疾病复发或仍承受较大疾病负担；生物制剂费用高昂且停药后复发常见，许多患者需要长期治疗；注射给药可能导致部分患者产生治疗相关焦虑。因此，生物制剂通常保留用于未控制的的中重度AD患者，而轻中度AD患者的治疗选择有限。物理等离子体主要由带电粒子（包括电子和离子）组成，当气态介质暴露于外部能源时产生。等离子体的关键特征之一是其热状态，可从高温到非热条件不等。非热等离子体（nonthermal plasma，NTP），也称为冷大气等离子体（cold atmospheric plasma，CAP），自2000年代初以来已在皮肤科领域得到研究，应用包括皮肤感染治疗、伤口愈合和组织再生。使用AD小鼠模型的临床前研究报告NTP可调节免疫反应以减少特应性诱导因子，并能改善AD样皮肤炎症。然而，关于NTP设备用于慢性炎症性皮肤病的临床证据仍然有限。非热氩等离子体（non-thermal argon plasma，NAP）是NTP的一种亚型，以氩气为工作气体，因其良好的安全性特征和潜在的皮肤科应用而受到越来越多的关注。尽管NAP在实验研究中显示出有前景的生物学效应，但其在AD患者中的临床疗效和潜在机制仍很大程度上未被探索。因此，研究人员开展了一项探索性研究，以评估NAP在轻中度AD患者中的疗效和安全性。研究人员重点关注角质形成细胞氧化应激（oxidative stress，OS）的调节和IL-33信号通路作为NAP治疗AD的潜在机制。基于临床和实验发现，研究人员提出NAP可能代表一种新型、安全的轻中度AD治疗选择。
为开展本研究，研究人员采用的主要关键技术方法包括：一项双盲、随机、假对照、平行设计、I期临床试验，纳入15例轻中度AD成人患者（NAP组10例，假对照组5例），于2021年9月至2023年1月在Ajou大学医院开展；采用16S rRNA基因V3-V4高变区测序结合DADA2和QIIME 2进行皮肤微生物组分析；使用屋尘螨（HDM）提取物诱导的NC/Nga小鼠AD模型进行体内机制研究；采用RNA测序（RNA-seq）、实时聚合酶链反应（real-time PCR）、Western blot和免疫荧光分析相关分子表达；使用HaCaT角质形成细胞系进行体外ROS检测及细菌共培养实验；使用金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 6538）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）进行杀菌实验。
研究结果如下：
NAP治疗缓解轻中度AD的急性湿疹性皮损：15例参与者纳入研究，NAP组10例接受活性治疗，假对照组5例。与基线（V2）相比，第4周（V10）时NAP治疗组EASI评分显著降低，NRS和DLQI评分亦显著下降，而假对照组无显著变化。经皮水分丢失（TEWL）和总免疫球蛋白E（IgE）未见显著变化。结果表明NAP治疗1分钟即可显著缓解AD症状、减轻瘙痒并改善生活质量，可能主要通过缓解局部炎症和瘙痒而非系统免疫调节或直接屏障修复发挥作用。
NAP治疗对皮肤微生物群落有显著影响：16S rRNA测序分析显示，NAP治疗后皮肤微生物组组成发生显著改变，Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia和Lactobacillus等属相对丰度增加，而与AD相关的葡萄球菌属（Staphylococcus）减少。V10时NAP治疗与α多样性降低相关，仅在非皮损皮肤中达到统计学显著性。β多样性分析显示微生物组成主要按治疗组而非皮损状态聚类。结果表明NAP治疗与皮肤微生物组的显著改变相关，但这些变化不能直接解释急性AD皮损的特异性临床改善。
金黄色葡萄球菌对液体等离子体杀菌作用的敏感性高于植物乳杆菌：体外实验显示，与液体等离子体共孵育后金黄色葡萄球菌被完全杀灭，而植物乳杆菌更具抵抗力。与金黄色葡萄球菌共培养可增加HaCaT细胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，而与植物乳杆菌共培养无此效应。提示NAP相关的葡萄球菌减少可能通过减弱角质形成细胞ROS产生和氧化应激而促进临床改善。
NAP治疗改善小鼠HDM诱导的AD：使用NC/Nga小鼠经屋尘螨提取物诱导AD后给予NAP治疗，NAP显著缩小AD样皮损范围，抑制免疫细胞募集（ particularly肥大细胞和嗜酸性粒细胞），并显著减轻表皮棘层肥厚这一AD特征性组织病理学表现。
等离子体治疗抑制AD诱导小鼠皮肤中的过敏性炎症：RNA-seq显示NAP治疗后包括Il33在内的多种细胞因子和趋化因子显著下调。Real-time PCR证实NAP抑制Il33转录，并显著降低Ccl2和Ccl5转录水平。IL-33蛋白水平与mRNA结果一致，AD皮肤中升高，NAP治疗后显著降低。Western blot显示AD诱导小鼠皮肤中髓样分化初级反应蛋白88（MYD88）和磷酸化AKT（p-AKT）水平升高，NAP治疗后可降低，免疫荧光证实p-AKT强度在AD皮损中增加并于NAP治疗后显著降低。结果表明NAP减弱AD诱导小鼠皮肤中IL-33相关炎症信号。
等离子体治疗降低AD诱导小鼠皮肤中的氧化应激：AD诱导小鼠皮肤中总ROS水平升高，NAP治疗可抑制这一升高；活性氮 species（RNS）水平呈类似模式。AD诱导小鼠皮肤中核因子E2相关因子2（NRF2）及抗氧化蛋白（包括CAT、GPX、NQO1、SOD1和SOD2）表达增加，NAP治疗后减弱。在HaCaT细胞中，LPS刺激诱导NRF2表达，等离子体处理进一步增强NRF2表达；使用NRF2抑制剂可削弱液体等离子体的抗氧化活性。结果表明等离子体治疗通过NRF2通路增强抗氧化防御，从而可能对抗升高的氧化应激并缓解AD样症状。
讨论部分总结：本研究证明NAP可改善AD患者的急性湿疹性皮损，并通过AD小鼠模型探讨其潜在机制，发现NAP可能独立于皮肤微生物组改变而减弱角质形成细胞中IL-33表达和氧化应激。人类皮肤微生物组分析显示NAP治疗区域α多样性降低并伴随症状改善，这与既往报道临床改善时α多样性增加的研究不同，可能提示微生物组组成与AD严重度之间关系的复杂性；微生物组改变应被解释为相关性发现而非NAP治疗作用的直接因果证据。多项研究强调OS在AD中的作用，但角质形成细胞中OS的调控复杂，直接研究其与临床改善关联的工作较少，本研究结果与既往AD患者OS增加及减轻OS可能促进临床改善的报道一致。IL-33是与炎症反应相关的细胞因子，其失调涉及多种Th2介导疾病的发病机制；AD患者角质形成细胞中IL-33水平升高，靶向IL-33或其受体的单克隆抗体已进入临床开发，但近期研究显示IL-33靶向抗体在慢性或重度AD患者中未必产生显著临床改善。慢性AD与急性AD不仅临床表现不同，还存在持续免疫失调、表皮重塑和更复杂的炎症环境，提示IL-33以外的致病通路参与疾病持续。因此，本研究仅纳入以急性湿疹性皮损为主的轻中度AD患者，其发现不应直接外推至慢性或重度AD；数据提示急性皮损可能对IL-33通路调节更为敏感，NAP可能在一定程度上影响IL-33信号从而促进临床改善。本研究存在若干局限性：探索性设计和样本量小限制普适性，但研究期间未观察到严重不良事件，在探索性试验范围内支持NAP良好的安全性特征；未进行全宏基因组测序进行种水平分析，无法进行功能注释和详细评估NAP对皮肤微生物组的影响，因拭子标本细菌DNA不足；虽支持NAP通过调节NRF2表达减轻OS的作用，但未确定NAP是否降低人类皮肤OS或评估其对人类皮肤其他细胞成分的体内效应，机制发现应视为探索性和生物学支持性而非人类临床疗效机制的直接证据；临床部分因研究启动时行政疏忽未完成前瞻性注册，于参与者随访完成后回顾性注册，可能引入选择性报告偏倚，但临床结局均在入组前IRB批准方案中预先指定并全部报告。未来研究应评估NAP对慢性皮损的效应并进行长期随访，开展更广泛的安全性评估（如治疗前后皮肤组织病理学）以及与常规AD治疗（包括外用糖皮质激素）的头对头比较。
研究结论翻译：尽管存在上述局限性，这项探索性研究提示NAP可能改善轻中度AD，尤其是急性湿疹性皮损，并代表一种有前景的非药物治疗选择。小鼠和体外模型的发现进一步支持NRF2相关抗氧化反应和IL-33信号减弱可能参与其治疗效应。
