《Veterinary Immunology and Immunopathology》：Transcriptomic profiling of goats' systemic immune response to
Haemonchus contortus infection during primary and secondary infection
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摘要：捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是一种在全球范围内影响小型反刍动物的经济上重要的胃肠道线虫。理解初次与二次暴露期间的免疫应答可为改进控制策略提供依据。本研究利用RNA测序（RNA sequencing）技术，对波尔山羊（Boer
摘要：捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是一种在全球范围内影响小型反刍动物的经济上重要的胃肠道线虫。理解初次与二次暴露期间的免疫应答可为改进控制策略提供依据。本研究利用RNA测序（RNA sequencing）技术，对波尔山羊（Boer goat）在初次感染（primary infection）早期（D5）和晚期（D21）以及二次感染（secondary infection）相应时间点的棕黄层（buffy-coat）样本中的系统性免疫转录应答进行了研究（N=6；每3只动物混合为一个池）。数据采用CLC Genomics Workbench进行分析，功能富集分析使用STRING数据库，免疫通路分析使用KEGG数据库。差异基因表达分析（p-值≤0.05）在初次感染的D5和D21分别鉴定出252个和330个上调基因，在二次感染的D5和D21分别鉴定出373个和269个上调基因。初次感染的特征是以中性粒细胞相关的促炎性信号为主，涉及CXCL8–CXCR1/2、CSF3R/CSF2R、IL-6–STAT3/5以及MYD88–MAPK信号通路。二次感染在D5表现出早期的Th2相关特征，包括STAT6、IL4和IL13的上调。然而，典型的Th2相关基因在D21并未上调，GATA3和STAT4在两次感染中均下调，表明存在时间依赖性应答。其他变化涉及IL-10/IL-10R、IL-4R/IL-13RA1、SOCS和DUSP信号通路。功能富集分析鉴定了Th2相关免疫、补体激活、白细胞迁移、抗原加工与呈递、B细胞受体（B-cell receptor）以及T细胞受体（T-cell receptor）信号通路。这些发现表明，初次和二次暴露后的系统性应答呈现时间上的差异性，而非持续的辅助性T细胞极化。这些特征可能反映了白细胞组成的改变、细胞特异性转录调控，或两者兼有。总体而言，这些发现鉴定了与初免和既往暴露宿主对H. contortus免疫应答相关的候选免疫通路和特征，并为未来的疫苗和遗传抗性研究奠定了基础。
研究背景与研究目的
捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是全球热带和亚热带地区小型反刍动物生产系统中造成最严重健康挑战的胃肠道线虫。长期以来，驱虫药被用于治疗感染，但耐药性问题日益严峻。目前仅有一款针对绵羊的注册疫苗Barbervax?（英国和澳大利亚）/Wirevax?（南非），但在山羊中保护效力不足70%。研究表明山羊比绵羊对该寄生虫更易感，然而相较于绵羊，山羊的免疫应答和分子抗性机制研究相对匮乏。现有研究多局限于特定时间点、组织或品种，缺乏利用转录组学纵向剖析山羊初次与二次感染过程中系统性免疫应答的研究。因此，深入理解山羊在初次和二次感染不同阶段的免疫转录动态，对于开发替代性可持续防控策略（如培育遗传抗性山羊和免疫学控制手段如疫苗）至关重要。
本研究旨在：（1）鉴定在不同感染阶段与H. contortus感染相关的关键免疫基因和通路；（2）区分初次与二次应答的转录组学特征。据研究人员所知，这是非洲首个在实验性初次和二次感染波尔山羊中阐明全身性免疫应答机制和通路的免疫转录组学研究。
主要关键技术方法
研究人员采用纵向研究设计，将6只雌性波尔山羊（Capra aegagrus hircus）在隔离条件下饲养至3-4月龄后，经口给予5000个H. contortus第三期幼虫（L3）进行初次感染。在第29天使用STARTECT?驱虫，14天后再次给予相同剂量幼虫进行二次感染。分别在感染前（D0）、初次感染第5天（D5PI）和第21天（D21PI）、二次感染第5天（D5SI）和第21天（D21SI）采集颈静脉血制备棕黄层（buffy coat）。RNA提取后，将每组6只动物随机分为两个独立的生物学重复池（每池3只），送至南非农业研究委员会-生物技术平台（ARC-BTcore）使用DBSEQ-G400平台进行RNA测序。数据分析使用CLC Genomics Workbench 9.5.2，序列比对至从KEGG通路数据库预选的Capra hircus免疫参考直系同源基因转录本序列列表（n=10168）。差异表达基因（DEGs）筛选标准为倍数变化≥±1.2且p-值≤0.05，功能富集分析使用STRING v12.0，免疫通路分析和可视化使用KEGG通路数据库。
研究结果
3.1 寄生虫学和临床参数：感染期间粪便虫卵计数（FEC）升高、红细胞压积（PCV）下降及FAMACHA评分增加，证实了进行性寄生虫性贫血和临床症状。二次感染后期FEC进一步升高，PCV持续下降，表明寄生虫负担加重。
3.2 免疫应答相关基因定位与生物信息学分析：四个比较转录组数据集共获得4290万至9180万条原始读段。标准化RPKM均值散点图显示各时间点与D0对照间呈强正相关性（r=0.95-0.97）。
3.3 差异表达的免疫基因：初次感染D5PI和D21PI分别有252个和330个免疫基因上调，二次感染D5SI和D21SI分别有373个和269个上调。维恩图显示仅有4个基因在初次感染两个时间点重叠，二次感染同样仅有4个基因重叠，而105个基因在所有四个时间点均上调。多个基因在感染不同阶段显著下调，如VWF、BAC5等7个基因在两次感染的D5均下调；二次感染D21SI观察到T细胞活化、抗原呈递和免疫信号相关基因（如PRKCQ、CD28、MHC class II等）的下调。
3.4 基因本体论（GO）富集分析：D5PI富集的生物学过程包括细胞因子介导的信号通路、MAPK级联调控等；D21PI新增I型干扰素产生正向调节、白细胞增殖调节等；D5SI与初次感染相似但额外富集免疫系统正向调节；D21SI则以白细胞增殖正向调节、炎症反应和防御应答为主。
3.5 免疫通路富集分析：仅在初次感染富集的通路有C型凝集素受体信号、自噬和细胞因子-细胞因子受体相互作用。初次与二次感染共有的通路包括趋化因子信号、FcγR介导的吞噬作用、MAPK信号、TNF信号、JAK-STAT信号和NOD样受体信号。二次感染D5特异性富集B细胞受体（BCR）信号、T细胞受体（TCR）信号和ErbB信号通路；D21SI则富集PI3K-Akt信号和FcεRI信号通路。
3.6 早期感染免疫应答转录组特征：D5PI以中性粒细胞相关促炎特征为主，表现为CXCL8-CXCR1/2、CSF3R/CSF2RA/B、IL-6家族细胞因子及MYD88-MAPK级联的激活，促进髓系扩增和氧化爆发。D5SI则转向适应性调节特征，包括Th2相关基因（STAT6、IL4、IL13）上调，以及IL-10/IL-10R、IL-4R/IL-13RA1信号通过JAK/STAT传导，伴随SOCS1/5负反馈和DUSPs对MAPK活性的调节。
3.7 晚期感染免疫应答转录组特征：D21PI显示抗原加工与呈递通路（BOLA class I、TAP1/2、CD74、CTSS）和BCR信号通路（LYN、SYK、AKT1等）的激活。D21SI则富集TCR信号通路（LCP2、VAV3、MAP2K7等）。在Th1/Th2分化通路中，初次感染有14个基因上调（如IL4R、STAT5B、NOTCH1/2、JAK1/2等），二次感染有9个基因上调（如FOS、MAPK3等）。值得注意的是，典型Th1（TBX21、STAT4、IFNG）和Th2（GATA3、STAT6、IL4、IL5、IL13）谱系定义基因在D21均未上调，且GATA3和STAT4在两次感染的D21均下调。Th17分化通路相关组分在初次感染中更广泛地激活。
讨论与结论
本研究发现山羊对H. contortus的系统性免疫应答呈现时间动态特征：早期初次感染以中性粒细胞驱动的急性促炎反应为主，涉及CXCL8-CXCR1/2、CSF3R、IL-6-STAT3/5和MYD88-MAPK信号；而二次感染早期则迅速转向Th2和记忆相关程序，表现为STAT6、IL4、IL13上调以及IL-10/IL-10R、IL-4R/IL-13RA1信号的参与。晚期感染阶段，尽管抗原加工呈递、BCR和TCR信号通路被激活，但典型Th1/Th2谱系标志基因并未持续高表达，反而观察到GATA3和STAT4的下调，提示不存在持续的辅助性T细胞极化状态。这种时间依赖性的转录变化可能反映了宿主-寄生虫之间持续的“推拉”博弈——寄生虫抑制免疫识别，而宿主试图重建有效免疫。研究还发现二次感染晚期出现了广泛的淋巴细胞活化、抗原呈递和干扰素信号相关基因的下调，暗示寄生虫可能通过免疫抑制机制逃逸宿主防御。
研究人员得出结论：山羊对H. contortus初次和二次感染的系统性免疫应答呈现时间上截然不同的特征，而非持续的辅助性T细胞极化。这些特征可能反映了白细胞组成的变化、细胞特异性转录调控或两者共同作用。本研究鉴定的候选免疫通路和特征为未来疫苗开发和遗传抗性研究奠定了重要基础。
